باستخدام هذا البروتوكول، سوف نبرهن على عملية خطوة بخطوة لحفز الجذور المشعر في الحنطة السوداء التراتري للمرة الأولى. هذه التقنية هي سهلة وغير مكلفة للبدء في الجينوم والميكروبات للحنطة السوداء التراتري وغيرها من النباتات. على الرغم من أن يتم تعيين هذه الطريقة مفصلة للحنطة السوداء التراتري، فإنه يمكن تطبيقها على غيرها من النباتات dicot مع بعض التعديلات.
على الرغم من أن هذا الأسلوب من السهل تنفيذ، فقد العديد من الخطوات التفصيلية. يمكن أن يساعد العرض التوضيحي المرئي الباحثين على تحقيق تحريض أكثر كفاءة للجذور المشعر. وسوف يكون إثبات الإجراء غوانغتاو تشيان، وهو طالب الماجستير من مختبري.
تبدأ من خلال اختيار بذور الحنطة السوداء التراتري الممتلئة وغير التالفة ونقع البذور في 28 درجة مئوية من الماء لمدة 20 دقيقة تقريبا. عندما معطف البذور يمكن إزالتها بسهولة، ضع 100 إلى 200 بذور مقشرة في قارورة مخروطية معقم 100 ملليلتر تحتوي على 75٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية. في نهاية التعقيم، استبدال الإيثانول مع 5٪ هيبوكلوريت الصوديوم.
بعد 15 دقيقة، قم بفك هيبوكلوريت الصوديوم وغسل البذور بالماء المعقم المُعَمَّن خمس مرات. ثم لطخة البذور الجافة مع قطعة من الورق المعقم. للحصول على شتلات التراتاري الحنطة السوداء، إضافة 10 بذور في زجاجة إلى الفردية 300 ملليلتر زجاجات زراعة الأنسجة النباتية التي تحتوي على 50 ملليلتر من المتوسطة MSSA.
ثم انبات البذور في غرفة الثقافة في 25، زائد أو ناقص 1، درجة مئوية في ظل ظروف الضوء. بعد 7 إلى 10 أيام، حدد الشتلات القوية مع قطعتين من كوتيلينجدونات متكشفة وقطع الشتلات من الجذور. ضع الشتلات في طبق بتري معقمة وقطع المهابوكول إلى شرائح 0.8 إلى 1 سنتيمتر.
مجرد كوتيلونز في ما يقرب من 0.5 قطع سنتيمتر وقبل الثقافة explants الناتجة تحت ظروف الضوء لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، نقل explants إلى قارورة مخروطية معقم 100 ملليلتر. لتنشيط A.rhizogenes، ذوبان الثقافة على الجليد قبل طلاء بالتساوي البكتيريا على وسيط صلب YEB مع المضادات الحيوية لاحتضان 12 إلى 16 ساعة في 28 درجة مئوية.
في صباح اليوم التالي، اختر مستعمرة أحادية النسيلة للثقافة في طبق بتري جديد كما هو موضح للتو. بعد حضانة أخرى من 12 إلى 16 ساعة ، تلقيح المستعمرات أحادية النسيلة الناتجة في قارورة مخروطية معقمة تبلغ 100 ملليلتر تحتوي على 20 ملليلترًا من وسيط YEB صلب مع المضادات الحيوية عند 28 درجة مئوية و 200 ثورات في الدقيقة لمدة 16 إلى 18 ساعة حتى تصل الكثافة البصرية في 600 إلى 2.0. ثم نقل 2-4٪ من ثقافة الخلايا البكتيرية إلى قارورة مخروطية جديدة 100 ملليلتر تحتوي على 20 ملليلتر من الوسيلة الصلبة الطازجة YEB مع المضادات الحيوية عند 28 درجة مئوية و 200 ثورة في الدقيقة لمدة 4 إلى 5 ساعات حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى حوالي 0.5.
للحث على تحويل الجذر المشعر، نقل ثقافة A.rhizogenes إلى أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر وجمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي. resuspend بيليه في MSSAS المتوسطة إلى كثافة بصرية من حوالي 0.2 وضخ التعليق في قارورة explants. بعد 10 دقائق، إزالة explants من القارورة ولطختها بقطعة من الورق ثنائي التبخس العقيم.
ثم ضع قطعة معقمة قطرها 9 سنتيمترا من ورق التصفية على طبق من MSSAAS المتوسطة وتراكب explants على ورقة التصفية لاحتضان لمدة ثلاثة أيام في 25 درجة مئوية في الظلام. في نهاية الحضانة، نقل ما يقرب من 20 explants المصابة على MSSACK المتوسطة ورأسيا احتضان النباتات تحت ظروف خفيفة في 25، زائد أو ناقص 1، درجة مئوية. بعد 10 إلى 14 يوما من الثقافة، حدد جذور شعر مما يدل على مظهر أبيض والنمو السريع وقطع الجذور إلى قطعتين إلى ثلاثة سنتيمترات.
من الواضح أنّ الجذور على مقعد نظيف. الاستزراع الفرعي قطع الجذر في قارورة مخروطية معقم 100 ملليلتر تحتوي على وسط MSSK عند 25 درجة مئوية و 80 ثورات في الدقيقة في الظلام حتى يُبرّر إلى قاع القارورة. لتحديد الجذور المشعر، إزالة أي جذور شعر التواني والملوثة واختيار تلك مع مظهر أبيض.
إذا تم استخدام جين مراسل، تحقق من الجذور لفلوريسنس تحت الترانويلوميناتور مزدوج أو مزدوج مزدوج فوق البنفسجي وحدد الجذور المشعرة التي تظهر إشارة فلورية قوية. ثم جفف الجذور بورق ماصة ولفها برقائق الألومنيوم المميزة للتحليل الفوري. لتخزين على المدى الطويل، lyophilize الجذور في النيتروجين السائل ووضع الجذور في ناقص 80 درجة مئوية حتى التحقيق.
بعد التحول الجيني والثقافة، كما هو موضح، سوف تظهر جذور شعر لون أبيض رقيق وبطريقة plagiotropic في مواقع الجروح من explants وتشكيل مصفوفة متفرعة للغاية ومتشابكة. ويمكن استخدام جين المراسل لتسهيل التفريق بين الجذور المشعة المعدلة وراثيا تحت الترانسيوم فوق البنفسجية المزدوجة أو الزرقاء أو الخفيفة، أو تحديد جينة مستهدفة ذات أهمية. هنا ، يظهر التعبير النسبي لعامل النسخ الناتج عن الضوء في الخطوط المعدلة وراثياً للجذور المشعرة التراتية.
وتجدر الإشارة إلى أن التركيب الحيوي للروتين والكويرسيتين يتم الترويج له أيضًا على المستوى الأيضي استجابةً لفرط التعبير عن عامل النسخ المستحث. وعلاوة على ذلك، فإن التعبير الجيني النسبي لجينات مسار تخليق الفلافينويد في جميع الخطوط الثلاثة المعدلة وراثيا، أعلى بشكل ملحوظ من تلك التي تم قياسها في مجموعة التحكم، مما يشير إلى تحول ناجح في الجذر المشعر في الحنطة السوداء التراتاري. وهذا هو عدوى البذور، واختيار explants، وتركيز البكتيريا تؤثر مباشرة على نجاح الحث الجذر المشعر.
يمكننا تقييم التعبير الجيني، بروتين الحمض النووي، أو التفاعلات البروتينية البروتينية أو الإنتاج الضخم من الأيضات الثانوية لدراسة الأيضات الثانوية. البكتيريا المهندسة خطرة على البشر وبيئته. الحرص على التعامل مع, تشغيل, والتخلص من البكتيريا بشكل صحيح.
