Usando este protocolo, demostraremos el proceso paso a paso para inducir raíces peludas en trigo sarraceno tartar por primera vez. Esta técnica es fácil y económica para empezar a genómica y microbiomómica para el trigo sarraceno tartar y otras plantas. Aunque este método detallado está configurado para el trigo sarraceno tartar, se puede aplicar a otras plantas de dicot con algunas modificaciones.
Aunque este método es fácil de realizar, tiene muchos pasos detallados. La demostración visual puede ayudar a los investigadores a lograr una inducción de raíz peluda más eficiente. Demostrar el procedimiento será Guangtao Qian, un estudiante de maestría de mi laboratorio.
Comience seleccionando semillas de trigo sarraceno regordetas y sin daños y remojando las semillas en agua de 28 grados Celsius durante aproximadamente 20 minutos. Cuando la capa de semilla se pueda quitar fácilmente, coloque de 100 a 200 semillas peladas en un matraz cónico esterilizado de 100 mililitros que contenga 75% de etanol durante 30 segundos. Al final de la esterilización, reemplace el etanol con 5%hipoclorito sódico.
Después de 15 minutos, decantar el hipoclorito de sodio y lavar las semillas con agua desionizada estéril cinco veces. Luego seque las semillas con un pedazo de papel bibulous estéril. Para obtener plántulas de trigo sarraceno tartar, agregue 10 semillas por botella a botellas individuales de cultivo de tejido vegetal de 300 mililitros que contengan 50 mililitros de medio MSSA.
Luego, germinar las semillas en una sala de cultivo a 25, más o menos 1, grados Celsius en condiciones de luz. Después de 7 a 10 días, seleccione plántulas robustas con dos piezas de cotiledones desplegados y corte las plántulas de las raíces. Coloque las plántulas en un plato de petri estéril y corte los hipocotilos en segmentos de 0,8 a 1 centímetro.
Estriden los cotiledones en trozos de aproximadamente 0,5 centímetros y precultivo los explantes resultantes en condiciones de luz durante 24 horas. Al día siguiente, transfiera los explants a un matraz cónico esterilizado de 100 mililitros. Para activar A.rhizogenes, descongele el cultivo sobre hielo antes de encojerar uniformemente las bacterias en un medio sólido YEB con antibióticos durante una incubación de 12 a 16 horas a 28 grados centígrados.
A la mañana siguiente, elige una colonia monoclonal para el cultivo en un nuevo plato de petri como acabamos de demostrar. Después de otra incubación de 12 a 16 horas, inocular las colonias monoclonales resultantes en un matraz cónico esterilizado de 100 mililitros que contiene 20 mililitros de medio sólido YEB con antibióticos a 28 grados Celsius y 200 revoluciones por minuto durante 16 a 18 horas hasta que la densidad óptica a 600 alcance 2.0. A continuación, transfiera entre el 2 y el 4% del cultivo celular bacteriano a un nuevo matraz cónico de 100 mililitros que contenga 20 mililitros de medio sólido YEB fresco con antibióticos a 28 grados celsius y 200 revoluciones por minuto durante 4 a 5 horas hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance aproximadamente 0,5.
Para inducir la transformación de la raíz peluda, transferir el cultivo de A.rhizogenes a un tubo cónico estéril de 50 mililitros y recoger las bacterias por centrifugación. Resuspender el pellet en medio MSSAS a una densidad óptica de aproximadamente 0,2 e infundir la suspensión en el matraz de explantas. Después de 10 minutos, retire los explantes del matraz y sople con un pedazo de papel bibulous estéril.
A continuación, coloque un pedazo estéril de papel de filtro de 9 centímetros de diámetro en un plato de medio MSSAAS y superponga los explantes en el papel de filtro para una incubación de tres días a 25 grados celsius en la oscuridad. Al final de la incubación, transfiera aproximadamente 20 explantes infectados al medio MSSACK e incubar verticalmente las plantas en condiciones de luz a 25, más o menos 1 grados Centígrados. Después de 10 a 14 días de cultivo, seleccione las raíces peludas que demuestran un aspecto blanco y un crecimiento rápido y corte las raíces en piezas de dos a tres centímetros.
Numera claramente las raíces en un banco limpio. Subcultivo de las piezas de raíz en un matraz cónico esterilizado de 100 mililitros que contiene medio MSSK a 25 grados Celsius y 80 revoluciones por minuto en la oscuridad hasta que se generalizaron en exceso hasta que se generalizaron en el fondo del matraz. Para identificar las raíces peludas, retire las raíces peludas leonadas y contaminadas y seleccione aquellas con un aspecto blanco.
Si se utilizó un gen reportero, compruebe las raíces en busca de fluorescencia bajo un transilumumina ultra violeta doble azul o claro y seleccione las raíces peludas que exhiben una señal fluorescente fuerte. A continuación, seque las raíces con papel absorbente y envuélvalas en papel de aluminio marcado para su análisis inmediato. Para el almacenamiento a largo plazo, liofilizar las raíces en nitrógeno líquido y colocar las raíces en menos 80 grados Celsius hasta su investigación.
Después de la transformación genética y el cultivo, como se demostró, las raíces peludas exhibirán un color blanco esponjoso y una manera plagiotrópica en los sitios de heridas de los explantes y formarán una matriz altamente ramificada y entrelazada. Un gen reportero se puede utilizar para facilitar la diferenciación de las raíces peludas transgénicas bajo una transiluminación ultravioleta dual azul o ligera, o la identificación de un gen objetivo de interés. Aquí, se muestra la expresión relativa de un factor de transcripción inducido por la luz en las líneas transgénicas de las raíces peludas de trigo sarraceno tartar.
En particular, la biosíntesis de la rutina y la quercetina también se promueven a nivel metabólico en respuesta a la sobreexpresión del factor de transcripción inducida. Además, la expresión génica relativa de los genes de la vía de síntesis de flavenoides en las tres líneas transgénicas, son notablemente más altas que las medidas en el grupo de control, lo que indica una transformación de raíz peluda exitosa en explantes de trigo sarraceno tartar. Es decir, la infección de las semillas, la selección de los explantes, y la concentración de las bacterias afectan directamente el éxito de la inducción de la raíz peluda.
Podemos evaluar la expresión génica, las reacciones de proteínas de ADN o proteínas o la producción en masa de metabolitos secundarios para estudiar los metabolitos secundarios de la regulación transcripcional. Las bacterias diseñadas son peligrosas para los humanos y su medio ambiente. Tenga cuidado de manejar, operar y desechar las bacterias correctamente.
