アグロバクテリウム・リゾゲネスによる毛深い根を誘発する -タータルソバにおける媒介性形質転換(ファゴピラム・タタリカム)

このプロトコルを用いて、初めて、酒根のそばに毛深い根を誘導するステップバイステップのプロセスを紹介します。この技術は、タータリーそばや他の植物のためのゲノミクスやマイクロバイオミクスを開始するための簡単かつ安価です。この詳細な方法は、タータリーそばのために設定されていますが、それはいくつかの変更を加えた他の二分植物に適用することができます。

この方法は簡単に実行できますが、多くの詳細な手順があります。視覚的なデモンストレーションは、研究者がより効率的な毛深い根誘導を達成するのに役立ちます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の修士課程の学生、広田銭です。

まず、ふっくらと損傷していないタルトのそばの種を選択し、約20分間摂氏28度の水に種を浸すことから始めます。種子コートを容易に除去できたら、75%エタノールを含む100ミリリットルの円錐形フラスコに100〜200種を30秒間置く。滅菌の終わりに、エタノールを5%次亜塩素酸ナトリウムに交換する。

15分後、次亜塩素酸ナトリウムをデカントし、滅菌脱イオン水で種子を5回洗います。その後、無菌のバイブル紙で種子を乾かします。酒木のそば苗を得るために、MSSA培地の50ミリリットルを含む個々の300ミリリットル植物組織培養ボトルにボトルあたり10種を加える。

その後、25、プラスマイナス1、光条件下で摂氏度で培養室で種子を発芽させます。7~10日後、2枚のコチルドンを持つ丈夫な苗を選び、根から苗を切ります。苗を無菌のシャーレに入れ、低コチルを0.8〜1センチメートルのセグメントに切ります。

コチルドンを約0.5センチメートルに分け、得られた外植物を光条件下で24時間培養する。翌日、外植を殺菌した100ミリリットルの円錐形フラスコに移す。A.rhizogenesを活性化するために、28°Cで12〜16時間のインキュベーションのために抗生物質でYEB固体培地に細菌を均等にめっくる前に氷上の培養物を解凍する。

翌朝、ちょうど実証したように、新しいシャーレで文化のためのモノクローナルコロニーを選びます。さらに12〜16時間のインキュベーションの後、600で光学密度が2.0に達するまで、20ミリリットルのYEB固体培地を含む100ミリリットルの円錐形フラスコに得られたモノクローナルコロニーを28°Cの抗生物質で、毎分200回転で接種する。その後、細菌細胞培養物の2〜4%を、28°Cの抗生物質を含む新鮮なYEB固体培地20ミリリットルを含む新しい100ミリリットルの円錐形フラスコに、600ナノメートルの光学密度が約0.5に達するまで4〜5時間、毎分200回転に移します。

毛深い根転移を誘発するには、A.rhizogenes培養物を無菌50ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離によって細菌を採取する。MSSAS培地中のペレットを約0.2の光学密度に再懸濁し、懸濁液を飛草のフラスコに注入する。10分後、フラスコから外植木を取り出し、滅菌バイブル紙でブロットします。

その後、MSSAAS培地の皿に無菌直径9センチメートルのフィルターペーパーを置き、暗闇の中で摂氏25度で3日間のインキュベーションのために濾紙に外植を重ねます。インキュベーションの終了時に、約20個の感染した外植物をMSSACK培地に移し、25、プラスマイナス1度、摂氏度で軽い条件下で植物を垂直にインキュベートする。10~14日間培養した後、白い外観と急速な成長を示す毛深い根を選択し、根を2〜3センチメートルに切ります。

明らかにクリーンベンチに根を番号付けします。25°CでMSSK培地を含む殺菌された100ミリリットルの円錐形フラスコに根片をサブ培養し、フラスコの底に広がるまで暗闇の中で毎分80回転培養する。毛深い根を識別するには、タウニーと汚染された毛深い根を取り除き、白い外観のものを選択します。

レポーター遺伝子を使用した場合は、青色または薄いデュアル紫外トランスイルミエーターの下で蛍光の根を確認し、強い蛍光シグナルを示す毛深い根を選択します。その後、吸水性紙で根を乾燥させ、すぐに分析するためにマークされたアルミニウム箔でそれらを包みます。長期保存のために、液体窒素中の根を凍結乾燥させ、調査までマイナス80度に根を置きます。

遺伝的変容と培養後、示されるように、毛深い根は外植の創傷部位にふわふわした白色とプラスジオトロピックの方法を示し、高度に分岐し、連結されたマトリックスを形成する。レポーター遺伝子は、青色または光二重紫外線トランスイルミネーション下でのトランスジェニック毛根の分化、または目的の標的遺伝子の同定を容易にするために使用することができる。ここで、タータリそば毛根のトランスジェニックラインにおける光誘発転写因子の相対的な発現が示されている。

特に、ルチンおよびケルセチンの生合成は、誘発転写因子過剰発現に応答して代謝レベルでも促進される。また、3つのトランスジェニックラインすべてにおけるフレーブノイド合成経路遺伝子の相対的な遺伝子発現は、対照群で測定されたものよりも著しく高く、タータリーそば外植で毛深い根形転換に成功したことを示す。すなわち種子の感染、外植の選択、及び細菌の濃度は毛深い根誘導の成功に直接影響を及ぼす。

遺伝子発現、DNAタンパク質、タンパク質タンパク質反応、二次代謝産物の大量生産を評価して、転写調節二次代謝産物を研究することができます。設計された細菌は、人間と彼の環境に有害です。適切に細菌を処理し、操作し、処分するように注意してください。