En utilisant ce protocole, nous démontrerons le processus étape par étape pour induire des racines poilues dans le sarrasin tartary pour la première fois. Cette technique est facile et peu coûteuse pour commencer à génomique et microbiomics pour le sarrasin tartary et d’autres plantes. Bien que cette méthode détaillée soit mise en place pour le sarrasin tartary, elle peut être appliquée à d’autres plantes de dicot avec quelques modifications.
Bien que cette méthode soit facile à exécuter, elle a de nombreuses étapes détaillées. La démonstration visuelle peut aider les chercheurs à obtenir une induction plus efficace des racines poilues. Guangtao Qian, étudiant à la maîtrise de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Commencez par choisir des graines de sarrasin tartary dodues et intactes et trempez les graines dans de l’eau de 28 degrés Celsius pendant environ 20 minutes. Lorsque la couche de graines peut être facilement enlevée, placer 100 à 200 graines pelées dans un flacon conique stérilisé de 100 millilitres contenant 75 % d’éthanol pendant 30 secondes. À la fin de la stérilisation, remplacer l’éthanol par de l’hypochlorite à 5 % de sodium.
Après 15 minutes, décanter l’hypochlorite de sodium et laver les graines avec de l’eau déionisée stérile cinq fois. Puis éponger les graines à sec avec un morceau de papier bibuleux stérile. Pour obtenir des semis tartary de sarrasin, ajouter 10 graines par bouteille aux bouteilles individuelles de culture de tissu végétal de 300 millilitres contenant 50 millilitres de milieu MSSA.
Ensuite, faire germer les graines dans une salle de culture à 25, plus ou moins 1, degrés Celsius dans des conditions de lumière. Après 7 à 10 jours, choisissez des semis robustes avec deux morceaux de cotylédons dépliés et coupez les semis des racines. Placer les semis dans une boîte de Pétri stérile et couper les hypocotyls en segments de 0,8 à 1 centimètre.
Sheer les cotyléons en morceaux d’environ 0,5 centimètre et la pré-culture des explantations résultantes dans des conditions légères pendant 24 heures. Le lendemain, transférez les explants dans un flacon conique stérilisé de 100 millilitres. Pour activer A.rhizogenes, décongelez la culture sur la glace avant de placage uniformément les bactéries sur le milieu solide YEB avec des antibiotiques pour une incubation de 12 à 16 heures à 28 degrés Celsius.
Le lendemain matin, choisissez une colonie monoclonale pour la culture dans une nouvelle boîte de Pétri comme nous venons de le démontrer. Après une autre incubation de 12 à 16 heures, inoculer les colonies monoclonales résultantes dans une fiole conique stérilisée de 100 millilitres contenant 20 millilitres de milieu solide YEB avec antibiotiques à 28 degrés Celsius et 200 révolutions par minute pendant 16 à 18 heures jusqu’à ce que la densité optique à 600 atteint 2,0. Ensuite, transférez 2-4% de la culture cellulaire bactérienne dans un nouveau flacon conique de 100 millilitres contenant 20 millilitres de milieu solide YEB frais avec des antibiotiques à 28 degrés Celsius et 200 révolutions par minute pendant 4 à 5 heures jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne environ 0,5.
Pour induire la transformation des racines poilues, transférez la culture A.rhizogenes dans un tube conique stérile de 50 millilitres et recueillez les bactéries par centrifugation. Resuspendez la pastille dans le milieu MSSAS à une densité optique d’environ 0,2 et infusez la suspension dans le flacon d’explants. Après 10 minutes, retirer les explants du flacon et les éponger avec un morceau de papier bibuleux stérile.
Ensuite, placez un morceau stérile de papier filtre de 9 centimètres de diamètre sur un plat de MSSAAS moyen et superposez les explants sur le papier filtre pour une incubation de trois jours à 25 degrés Celsius dans l’obscurité. À la fin de l’incubation, transférer environ 20 explants infectés sur mssack moyen et verticalement incuber les plantes dans des conditions légères à 25, plus ou moins 1, degrés Celsius. Après 10 à 14 jours de culture, sélectionnez les racines poilues démontrant un aspect blanc et une croissance rapide et coupez les racines en morceaux de deux à trois centimètres.
Numérotez clairement les racines sur un banc propre. Sous-culture des morceaux de racine dans un flacon conique stérilisé de 100 millilitres contenant le milieu MSSK à 25 degrés Celsius et 80 révolutions par minute dans l’obscurité jusqu’à ce qu’ils soient survolés vers le fond de la fiole. Pour identifier les racines poilues, enlever les racines poilues fauve et contaminées et sélectionner celles qui ont un aspect blanc.
Si un gène reporter a été utilisé, vérifiez la fluorescence des racines sous un transilluminateur bleu ou léger double ultra violet et sélectionnez les racines poilues qui présentent un signal fluorescent fort. Séchez ensuite les racines avec du papier absorbant et enveloppez-les dans du papier d’aluminium marqué pour une analyse immédiate. Pour le stockage à long terme, lyophiliser les racines dans l’azote liquide et placer les racines à moins 80 degrés Celsius jusqu’à leur enquête.
Après la transformation génétique et la culture, comme démontré, les racines poilues montreront une couleur blanche pelucheuse et une manière plagiotropique dans les emplacements de blessure des explants et formeront une matrice fortement ram ramée et imbriquée. Un gène reporter peut être utilisé pour faciliter la différenciation des racines poilues transgéniques sous une double transillumination ultraviolette bleue ou légère, ou l’identification d’un gène cible d’intérêt. Ici, l’expression relative d’un facteur de transcription induit par la lumière dans les lignes transgéniques des racines poilues tartary de sarrasin est montrée.
Notamment, la biosynthèse de la rutine et de la quertine est également promue au niveau métabolique en réponse à la surexpression induite du facteur de transcription. En outre, l’expression relative de gène des gènes flavenoid de voie de synthèse dans les trois lignes transgéniques, sont remarquablement plus élevées que celles mesurées dans le groupe témoin, indiquant une transformation poilue réussie de racine dans les explants tartary de sarrasin. C’est l’infection des graines, la sélection des explants, et la concentration des bactéries affectent directement le succès de l’induction poilue de racine.
Nous pouvons évaluer l’expression des gènes, les protéines de l’ADN, ou les réactions protéiques protéiques ou la production de masse de métabolites secondaires pour étudier la régulation transcriptionnelle des métabolites secondaires. Les bactéries modifiées sont dangereuses pour l’homme et son environnement. Prenez soin de manipuler, d’opérer et d’éliminer les bactéries correctement.
