Bu protokolü kullanarak, ilk kez tartary karabuğday kıllı kökleri indüklenmesi için adım adım süreci gösterecektir. Bu teknik, tartary karabuğday ve diğer bitkiler için genomik ve mikrobiyomik başlangıç için kolay ve ucuzdur. Bu ayrıntılı yöntem tartary karabuğday için kurulmuş olmasına rağmen, bazı değişiklikler ile diğer dicot bitkilere uygulanabilir.
Bu yöntemin gerçekleştirilemi kolay olsa da, birçok ayrıntılı adımı vardır. Görsel gösteri araştırmacılar daha verimli kıllı kök indüksiyon elde etmek için yardımcı olabilir. Prosedürü gösteren Guangtao Qian, benim laboratuvar bir Master öğrencisi olacaktır.
Tombul ve zarar görmemiş tartary karabuğday tohumları seçerek ve yaklaşık 20 dakika boyunca 28 derece santigrat suda tohumları ıslatma başlayın. Tohum kat kolayca kaldırılabilir zaman, 30 saniye boyunca% 75 etanol içeren sterilize 100 mililitre konik şişe içine 100 ila 200 soyulmuş tohum yerleştirin. Sterilizasyon sonunda, %5 sodyum hipoklorit ile etanol değiştirin.
15 dakika sonra, sodyum hipoklorit decant ve steril deiyonize su ile tohumları yıkayın beş kez. Sonra steril bibulous kağıt bir parça ile kuru tohumları leke. Tartary karabuğday fideleri elde etmek için, MSSA orta 50 mililitre içeren bireysel 300 mililitre bitki doku kültür şişeleri şişe başına 10 tohum ekleyin.
Sonra, 25, artı veya eksi 1, ışık koşullarında santigrat derece bir kültür odasında tohumları çimlendirmek. 7 ila 10 gün sonra, iki parça açılmakta olan cotyledons ile sağlam fideler seçin ve köklerden fideler kesti. Bir steril petri kabına fide yerleştirin ve 0,8 ila 1 santimetre segmentlere hipokotil kesti.
Yaklaşık 0,5 santimetre adet içine cotyledons Sheer ve ön kültür 24 saat boyunca ışık koşullarında ortaya çıkan eksplants. Ertesi gün, bir sterilize 100 mililitre konik şişe içine explants aktarın. A.rhizogenes'i aktive etmek için, bakterileri 28 santigrat derecede 12 ila 16 saatlik bir kuluçka için antibiyotiklerle YEB katı ortamına eşit olarak kaplamadan önce buz üzerindeki kültürü eritin.
Ertesi sabah, yeni bir petri kabında kültür için monoklonal bir koloni seçin. Başka bir 12-16 saat kuluçka sonra, 28 derece santigrat antibiyotik ile 20 mililitre YEB katı orta içeren sterilize 100 mililitre konik şişeler ortaya çıkan monoklonal koloniler aşılamak ve 600 optik yoğunluğu ulaşana kadar 16 ila 18 saat boyunca dakikada 200 devrimler 2.0 ulaşır. Daha sonra bakteri hücresi kültürünün %2-4'ünü, 600 nanometredeki optik yoğunluk yaklaşık 0,5'e ulaşana kadar dakikada 28 santigrat derece antibiyotik ve 200 devir de 20 mililitre taze YEB katı orta içeren 100 mililitrelik konik bir şişeye aktarın.
Kıllı kök dönüşümünü sağlamak için, A.rhizogenes kültürünü steril 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve bakterileri santrifüj le toplayın. MSSAS ortamındaki peleti yaklaşık 0,2 optik yoğunluğa geri alın ve süspansiyonu eksplin şişesine aşılayın. 10 dakika sonra, şişeden explants çıkarın ve steril bibulous kağıt bir parça ile onları leke.
Daha sonra mssaas orta bir çanak üzerine filtre kağıdı steril 9 santimetre çapında bir parça yerleştirin ve karanlıkta 25 santigrat derece üç günlük kuluçka için filtre kağıdı üzerine explants bindirme. Kuluçka sonunda, yaklaşık 20 enfekte eksültörü MSSACK orta ve dikey olarak 25, artı veya eksi 1, santigrat derece ışık koşullarında bitkiler inkübün üzerine aktarın. Kültür 10 ila 14 gün sonra, beyaz bir görünüm ve hızlı büyüme gösteren kıllı kökleri seçin ve iki ila üç santimetre adet kökleri kesti.
Temiz bir banktaki kökleri açıkça numaralandırmak. 25 santigrat derece ve karanlıkta dakikada 80 devrimler içeren sterilize edilmiş 100 mililitrelik konik şişedeki kök parçalarını, şişenin dibine kadar yayılanıncaya kadar alt kültür. Tüylü kökleri tanımlamak için, herhangi bir tawny ve kontamine tüylü kökleri kaldırmak ve beyaz bir görünüme sahip olanları seçin.
Bir muhabir geni kullanılmışsa, mavi veya açık çift ultraviyole transilluminator altında floresan için kökleri kontrol edin ve güçlü bir floresan sinyali sergileyen kıllı kökleri seçin. Sonra emici kağıt ile kökleri kuru ve hemen analiz için işaretli alüminyum folyo sarın. Uzun süreli depolama için, sıvı azot kökleri lyophilize ve araştırma kadar eksi 80 derece santigrat kökleri yerleştirin.
Genetik dönüşüm ve kültür den sonra, gösterildiği gibi, tüylü kökleri eksbitki lerinin yara sitelerinde kabarık beyaz bir renk ve plagiotropic bir şekilde sergileyecek ve son derece dallı ve birbirine kenetlenmiş matris oluşturacaktır. Bir muhabir gen mavi veya hafif çift ultraviyole transillumination altında transgenik tüylü köklerin farklılaşmasını kolaylaştırmak için kullanılabilir, ya da ilgi bir hedef gen belirlenmesi. Burada, tartary karabuğday kıllı köklerin transgenik hatlarında ışık kaynaklı transkripsiyon faktörügöreli ifadesi gösterilmiştir.
Özellikle, rutin ve quercetin biyosentezi de indüklenen transkripsiyon faktörü aşırı ekspresyona yanıt olarak metabolik düzeyde teşvik edilmektedir. Ayrıca, her üç transgenik çizgide flavenoid sentez yolu genlerinin göreceli gen ekspresyonu, kontrol grubunda ölçülenlerden oldukça yüksektir ve tartary karabuğday eksperlerinde başarılı bir tüylü kök dönüşümü gösterir. Bu tohum enfeksiyonu, ekseksektif seçimi, ve bakterilerin konsantrasyonu doğrudan tüylü kök indüksiyon başarısını etkiler.
Transkripsiyonel regülasyon sekonder metabolitleri incelemek için gen ekspresyonunu, DNA proteinini veya protein reaksiyonlarını veya sekonder metabolitlerin seri üretimini değerlendirebiliriz. Tasarlanmış bakteriler insanlar ve çevresi için tehlikelidir. Bakterileri düzgün bir şekilde ele almaya, çalıştırmaya ve bertaraf etmeye özen gösterin.
