研究伤口引起的多倍体化的果蝇模型

该协议可用于研究伤口引起的多倍体化。保存组织修复过程，细胞在成年果蝇中生长而不是分裂。一个简单的穿刺伤口可以在短短两天内诱导苍蝇上皮的多倍体。

然后，可以轻松评估上皮细胞大小、倍体和组织。首先收集两个小瓶，含有10至15个新关闭的雌性果蝇的菌株。在新鲜食物小瓶中老化苍蝇，每瓶大约5只雄性苍蝇在25摄氏度，直到三到五天大。

对于腹部受伤，在孵育结束时，使用单个0.1毫米不锈钢销组装多个销架，每个针的尖端起搏。在立体显微镜下，在二氧化碳飞垫上麻醉老年雌性果蝇。用画笔把苍蝇安排成一排。

戴上安全眼镜，一只手戴着针架，另一只手戴着钳子，用钳子将苍蝇的腹腹部朝上放置。然后刺穿目标 A4 两侧的成年雌性苍蝇在心腹中线搅拌之夜的上皮蓝色右侧区域内，将受伤的苍蝇返回食物小瓶，直到受伤的后所需的实验时间点。在实验终点，检查每个麻醉苍蝇在立体显微镜下是否存在伤口和疤痕，用格蕾丝的溶液填充九井玻璃解剖盘的一口井。

使用一对钳子，抓住受伤的雌性苍蝇的后侧胸部和淹没飞在溶液井。用另一只手，使用第二对钳子刺穿并去除目标 A6 以下的背节角质层，在果蝇的后部。如果内部器官未提取，则向腹部的后侧施加压力，以挤出剩余的器官。

使用钳子在目标 A2 上方的胸部交界处捕捉整个腹部，然后将腹部转移到包含大约 100 微升格蕾丝溶液的井中。当所有腹部都收集好时，将格蕾丝在收集井中的溶液体积减小到 30 微升。用一只手的钳子将腹部的侧侧向下，另一只手将威尼斯弹簧剪刀的下刀片插入每个腹部的腹腔，然后沿着后侧中线切割，直到腹部完全打开。

将 Grace 溶液的 30 微升添加到干燥解剖板的每个安装区域中，每个腹部安装区域有 4.1 毫米针脚，并将圆角腹部放入溶液液滴中。当所有腹部都经过圆角和放置时，将腹部固定在四个后角的盘子上。注意组织平躺，不撕裂或过度拉伸腹部组织。

然后，将 Grace 的解决方案替换为每个安装区域的固定解决方案 30 微升。并在每道菜的底部贴上胶带标签，以标记每个对照组和实验组。安装苍蝇组织样本。

染色后，使用钳子在立体显微镜下从解剖板上解开腹部。并使用钳子将每个样品的背侧板转移到单个玻璃盖滑单上约 30 微升安装介质中。在立体显微镜下，使腹部组织定向，使内侧朝下朝盖滑，并使用钳子将定向腹部拉到每个介质液滴的边缘。

将每个安装的盖滑放在标有玻璃幻灯片上。并使用实验室组织去除任何多余的安装介质。然后用透明指甲油密封盖滑的边缘，将幻灯片存放在四摄氏度的幻灯片盒中，直到其成像。

隔膜结蛋白快三，它标记细胞结，提供一个指标，在制备过程中是否发生任何处理扰动。必须丢弃且不包括在分析中，必须丢弃具有未污染区域较大划痕的、扰动伤口区域的腹部。当中央大型多核细胞覆盖伤口疤痕时，伤口修复完成。

上皮纸上大于10微米的间隙被认为是伤口闭合和再上皮化的缺陷。在这个具有代表性的分析中，使用具有抑制性线粒体细胞活化的苍蝇，52%的伤口无法在伤口鳞片上形成连续的上皮片。此膜伤口愈合文章提供了更多信息，以伤口修复缺陷的程度，允许重新上皮缺陷被分组为完全开放，部分关闭或完全关闭。

例如，在此实验中，通过同时阻断内皮复制和细胞融合抑制伤口诱导多倍体化，导致92%的上皮伤口保持完全开放。而细胞细胞周期的激活导致上皮伤口闭合缺陷。此外，通过加入胸腺素模拟EDDU来检测细胞周期活性，通过直接测量核DNA含量确定上皮倍数。

解剖腹部上皮时，注意不要用任何分离工具接触组织，因为这将划伤样品。解剖后，细胞增殖，细胞死亡，细胞损失切口大小或核DNA含量评估可以进行，以更好地了解伤口诱导多倍体化。或上皮内的其他过程。