该协议可用于研究伤口引起的多倍体化。保存组织修复过程,细胞在成年果蝇中生长而不是分裂。一个简单的穿刺伤口可以在短短两天内诱导苍蝇上皮的多倍体。
然后,可以轻松评估上皮细胞大小、倍体和组织。首先收集两个小瓶,含有10至15个新关闭的雌性果蝇的菌株。在新鲜食物小瓶中老化苍蝇,每瓶大约5只雄性苍蝇在25摄氏度,直到三到五天大。
对于腹部受伤,在孵育结束时,使用单个0.1毫米不锈钢销组装多个销架,每个针的尖端起搏。在立体显微镜下,在二氧化碳飞垫上麻醉老年雌性果蝇。用画笔把苍蝇安排成一排。
戴上安全眼镜,一只手戴着针架,另一只手戴着钳子,用钳子将苍蝇的腹腹部朝上放置。然后刺穿目标 A4 两侧的成年雌性苍蝇在心腹中线搅拌之夜的上皮蓝色右侧区域内,将受伤的苍蝇返回食物小瓶,直到受伤的后所需的实验时间点。在实验终点,检查每个麻醉苍蝇在立体显微镜下是否存在伤口和疤痕,用格蕾丝的溶液填充九井玻璃解剖盘的一口井。
使用一对钳子,抓住受伤的雌性苍蝇的后侧胸部和淹没飞在溶液井。用另一只手,使用第二对钳子刺穿并去除目标 A6 以下的背节角质层,在果蝇的后部。如果内部器官未提取,则向腹部的后侧施加压力,以挤出剩余的器官。
使用钳子在目标 A2 上方的胸部交界处捕捉整个腹部,然后将腹部转移到包含大约 100 微升格蕾丝溶液的井中。当所有腹部都收集好时,将格蕾丝在收集井中的溶液体积减小到 30 微升。用一只手的钳子将腹部的侧侧向下,另一只手将威尼斯弹簧剪刀的下刀片插入每个腹部的腹腔,然后沿着后侧中线切割,直到腹部完全打开。
将 Grace 溶液的 30 微升添加到干燥解剖板的每个安装区域中,每个腹部安装区域有 4.1 毫米针脚,并将圆角腹部放入溶液液滴中。当所有腹部都经过圆角和放置时,将腹部固定在四个后角的盘子上。注意组织平躺,不撕裂或过度拉伸腹部组织。
然后,将 Grace 的解决方案替换为每个安装区域的固定解决方案 30 微升。并在每道菜的底部贴上胶带标签,以标记每个对照组和实验组。安装苍蝇组织样本。
染色后,使用钳子在立体显微镜下从解剖板上解开腹部。并使用钳子将每个样品的背侧板转移到单个玻璃盖滑单上约 30 微升安装介质中。在立体显微镜下,使腹部组织定向,使内侧朝下朝盖滑,并使用钳子将定向腹部拉到每个介质液滴的边缘。
将每个安装的盖滑放在标有玻璃幻灯片上。并使用实验室组织去除任何多余的安装介质。然后用透明指甲油密封盖滑的边缘,将幻灯片存放在四摄氏度的幻灯片盒中,直到其成像。
隔膜结蛋白快三,它标记细胞结,提供一个指标,在制备过程中是否发生任何处理扰动。必须丢弃且不包括在分析中,必须丢弃具有未污染区域较大划痕的、扰动伤口区域的腹部。当中央大型多核细胞覆盖伤口疤痕时,伤口修复完成。
上皮纸上大于10微米的间隙被认为是伤口闭合和再上皮化的缺陷。在这个具有代表性的分析中,使用具有抑制性线粒体细胞活化的苍蝇,52%的伤口无法在伤口鳞片上形成连续的上皮片。此膜伤口愈合文章提供了更多信息,以伤口修复缺陷的程度,允许重新上皮缺陷被分组为完全开放,部分关闭或完全关闭。
例如,在此实验中,通过同时阻断内皮复制和细胞融合抑制伤口诱导多倍体化,导致92%的上皮伤口保持完全开放。而细胞细胞周期的激活导致上皮伤口闭合缺陷。此外,通过加入胸腺素模拟EDDU来检测细胞周期活性,通过直接测量核DNA含量确定上皮倍数。
解剖腹部上皮时,注意不要用任何分离工具接触组织,因为这将划伤样品。解剖后,细胞增殖,细胞死亡,细胞损失切口大小或核DNA含量评估可以进行,以更好地了解伤口诱导多倍体化。或上皮内的其他过程。