Questo protocollo può essere utilizzato per studiare la poliploidizzazione indotta dalla ferita. Un processo di riparazione dei tessuti di conservazione, in cui le cellule crescono invece di dividersi nella mosca della frutta adulta. Una semplice ferita da puntura può essere fatta per indurre poliploidia nell'epitelio della mosca entro soli due giorni.
Le dimensioni, la ploidia e l'organizzazione delle cellule epiteliali possono quindi essere valutate facilmente. Inizia raccogliendo due fiale, contenenti da 10 a 15 moscerini della frutta femminili appena chiusi del ceppo di interesse. E invecchiando le mosche in fiale di cibo fresco, con circa cinque mosche maschili per flaconcino a 25 gradi celsius, fino a tre o cinque giorni.
Per il mento addominale, alla fine dell'incubazione, utilizzare un singolo perno in acciaio inossidabile da 0,1 millimetri per assemblare diversi porta pin, con l'estremità affilata di ogni perno che cammina fuori. Anestetizza i moscerini della frutta femmina invecchiati su un fly pad di anidride carbonica al microscopio stereo. E usa un pennello per sistemare le mosche in fila.
Indossando occhiali di sicurezza, con un porta spillo in una mano e pin nell'altra, usa le pini per posizionare le mosche con i loro addome ventrali rivolti verso l'alto. Quindi forare la femmina adulta vola all'interno della regione destra blu epiteliale del bersaglio A4 su entrambi i lati della linea mediana ventrale mescolare le notti e riportare le mosche ferite al flaconcino alimentare fino al punto di tempo sperimentale desiderato dopo l'infortunio. All'endpoint sperimentale, verificare la presenza della ferita e della cicatrice in ogni mosca anestetizzata al microscopio stereo e riempire un pozzo di un piatto di dissezione in vetro a nove pozzetti con la soluzione di Grace.
Usando un paio di forcep, afferrare una femmina ferita volare sul lato dorsale del torace e immergere la mosca nel pozzo della soluzione. Con l'altra mano, utilizzare un secondo paio di pini per forare e rimuovere la cuticola dorsale sotto il bersaglio A6, nella parte posteriore della mosca della frutta. Se gli organi interni non vengono estratti, applicare pressione sul lato dorsale dell'addome per spremere gli organi rimanenti.
Utilizzare le forcep per spezzare l'addome completo alla giunzione del torace sopra il bersaglio A2 e trasferire l'addome in un pozzo contenente circa 100 microlitri della soluzione di Grace. Quando tutti gli addome sono stati raccolti, ridurre il volume della soluzione di Grace nella raccolta bene a 30 microlitri. Usa le forcep in una mano per tenere il lato dorsale dell'addome verso il basso e usa l'altra mano per inserire la lama inferiore delle forbici a molla veneziane nella cavità addominale di ogni addome e tagliare lungo la linea mediana dorsale fino a quando gli addome sono completamente aperti.
Aggiungere 30 microlitri della soluzione di Grace in ogni area di montaggio di una piastra di sezionazione asciutta con perni da 4,1 millimetri per area di montaggio addominale E posizionare l'addome filettato nella goccia di soluzione. Quando tutti gli addome sono stati filettati e posizionati, inchiodare gli addome al piatto sui quattro angoli dorsali. Fare attenzione che i tessuti giacciono piatti senza strappare o allungare eccessivamente il tessuto addominale.
Quindi sostituire la soluzione Grace con 30 microlitri una soluzione fissante per area di montaggio. E posizionare un'etichetta nastro sul fondo di ogni piatto per contrassegnare ogni controllo e gruppo sperimentale. Per montare i campioni di tessuto di mosca.
Dopo la colorazione, utilizzare le forcep per rimuovere gli addome dalla piastra di sezionazione sotto il microscopio stereo. E usa le forcep per trasferire ogni campione dal suo fianco dorsale in circa 30 microlitri di mezzo di montaggio su singoli scivolamenti di copertura in vetro. Al microscopio stereo orientare il tessuto addominale in modo che l'interno sia rivolto verso il basso verso lo slittamento della copertura e utilizzare le forcep per tirare gli addome orientati sul bordo di ogni goccia mediale.
Posizionare ogni coperchio montato su uno scivolo di vetro etichettato. E usa un tessuto da laboratorio per rimuovere qualsiasi mezzo di montaggio in eccesso. Quindi sigillare i bordi del coperchio scivolare con smalto chiaro e conservare le diapositive nella casella di scorrimento a quattro gradi celsius fino alla loro immagine.
La proteina di giunzione del setto veloce tre che etichetta le giunzioni cellulari, fornisce un indicatore se si sono verificate perturbazioni di lavorazione durante la preparazione. Gli addome con grandi graffi di area non macchiata che pertturano l'area della ferita, devono essere scartati e non inclusi nell'analisi. La riparazione della ferita è completa quando una grande cellula centrale multinucleata copre la crosta della ferita.
Gli spazi vuoti superiori a 10 micrometri sul foglio epiteliale sono considerati difetti nella chiusura delle ferite e nella rotelializzazione. In questa analisi rappresentativa utilizzando mosche con attivazione cellulare mitotica inibita, il 52% delle ferite non è stato in grado di formare un foglio epiteliale continuo sulla crosta della ferita. Questo saggio di guarigione della ferita a membrana fornisce maggiori informazioni sull'entità del difetto di riparazione della ferita consentendo di raggruppare i difetti di roetelializzazione come completamente aperti, parzialmente chiusi o completamente chiusi.
Ad esempio, in questo esperimento l'inibizione della poliploidizzazione indotta dalla ferita mediante il blocco simultaneo della replicazione dell'endo e della fusione cellulare, ha causato il 92% delle ferite epiteliali a rimanere completamente aperte. Mentre l'attivazione del ciclo cellulare mitotico ha provocato un difetto epiteliale di chiusura della ferita. Inoltre, l'attività del ciclo cellulare è stata rilevata mediante incorporazione dell'EDU analogica della timidina e la ploidia epiteliale è stata determinata misurando direttamente il contenuto di DNA nucleare.
Quando si seziona l'epitelio addominale, fare attenzione a non toccare il tessuto con nessuno degli strumenti di disacranti in quanto ciò graffierà il campione. Dopo la dissezione, la proliferazione cellulare, la morte cellulare, le dimensioni dell'incisione della perdita cellulare o le valutazioni del contenuto di DNA nucleare possono essere eseguite per comprendere meglio la poliploidizzazione indotta dalla ferita. o altri processi all'interno dell'epitelio.
