从成人草原卷的神经性尼奇衍生的神经球培养

这种方法可以帮助研究神经原性利基的性别依赖差异，并了解它们的神经可塑性，这些变化突出了草原中的社会互动。神经球的测定是确定神经干细胞和祖细胞增殖和分化潜力的极好工具。首先，在被冰包围的表面上放置一个培养皿。

将大脑沉积在盘子上，加入20毫升的冷洗溶液。在日冕平面上，用手术刀将大脑分成两个组织块，在前后轴的脑力水平上执行切割。从骨块中提取辅助区或VZ组织，从骨块中提取凹陷陀螺（或DG）组织。

要解剖VZ，请用杜蒙钳子握住半球之一，并在组织下插入第二钳子的细尖，这些钳子与卡达特-普塔门一起行。沿背心-心轴打开钳子以分离组织，将 VZ 收集到具有两毫升冷洗溶液的离心管中。不要将两种动物的组织集中。

在另一半球重复微切除，将管与组织储存在冰上。要解剖DG，使用手术刀将冠状切入冠状块，获得两片，其中海马形成被观察。使用 Dumont 钳子握住其中一个切片，并在 DG 和 CA1 之间用另一个钳子进行水平切割。

然后，在 DG 和 CA3 之间进行垂直切口，以分离 DG。在第一个切片的另一个半球中重复解剖，然后在第二个切片中的两个半球重复解剖。在离心管中收集每卷的四个 DG 片。将离心管放在生物安全柜内，等待大约 10 分钟，让组织碎片被重力沉淀。

然后，取出洗涤液，并添加一毫升温暖的酶溶液到每个管。在37度下孵育管子10分钟。要分解组织片段，用一毫升的尖端上下移液，但移液器不超过30次。

在37摄氏度下重复孵育，然后再次移液组织。在每个管中加入9毫升N-2介质以稀释酶处理，并将管以200倍g离心4分钟。丢弃上经剂，用10毫升N-2介质清洗细胞，然后重复离心。

从每个管中去除上一提液，并分别将VZ和DG的细胞颗粒用两毫升和一毫升的B-27介质重新暂停。用40微米细胞滤株过滤每个细胞悬浮液，以去除任何非消化组织。培养超低附着24孔板中的过滤细胞，使用两口用于VZ的孔和一口用于DG的孔。每毫升成纤维细胞生长因子20毫微克，每毫升表皮生长因子20毫微克，然后在37摄氏度、5%二氧化碳和高湿度下孵育48小时。

孵育后，去除一半的培养基，代之以新鲜的B-27培养基，辅以双浓度的生长因子。每三天重复一次此过程。在不需要改变培养媒介的日子里，将生长因子添加到最终浓度为 1 倍。

神经球是由从辅助区分离出的神经干细胞和雌雄成年草原卷的凹陷陀螺形成。虽然在初级培养物中存在碎片，但在第一次通过后，只有神经球存在。从女性辅助区获得的神经球数量比从男性补助区获得的神经球数量多，或雌性或男性的凹陷陀螺，这表明获得的神经球数量取决于增殖区和卷性。

神经球的直径在8天、第11天和14天测量。在两个神经元区域，男性和女性的卷逐渐增加，但与来自女性大脑的神经球相比，来自男性大脑的神经球较小。粘附神经球在第六天有生长因子时出现特征，或第15天无生长因子。

在第六天，在未分化的条件下，神经球衍生细胞表达内丁，神经祖细胞的标记。也可以识别双皮质蛋白阳性细胞和增殖标记Ki-67，这表明存在神经元前体或不成熟的神经元。然而，Ki-67与DCX缺乏结肠化表明存在后线粒体神经细胞。

在第15天，在分化条件下，发现成熟的神经元和细胞与胶质表型，证明分离细胞的分化潜力。在尝试此协议时，请记住，能够识别和有以前在微切除方面的实践是将细胞从神经原性利基中分离出来的根本。按照这个协议，实验可以设计成与神经干细胞和祖细胞的增殖、分化和存活有关的机制，这些机制在草原卷中仍然不为人知。