이 방법은 신경 질각에 있는 성 의존적인 다름을 조사하고, 그들의 신경 가소성을 이해하기 위하여, 대초원 vole에 있는 사회적인 상호 작용을 강조하는 변경을 이해하는 것을 도울 수 있습니다. 신경구의 분석은 신경 줄기와 선조 세포의 증식 및 분화 잠재력을 결정하는 훌륭한 도구입니다. 먼저 얼음으로 둘러싸인 표면에 페트리 접시를 놓습니다.
접시에 뇌를 착하하고 차가운 세척 용액 20 밀리리터를 추가하십시오. 관상 동맥 평면에서, 메스를 사용하여 조직의 두 블록으로 뇌를 분할, 전방 후방 축에서 bregma 수준에서 절단을 수행. 소달 블록으로부터, 또는 상기 소염기류, 또는 DG로부터, 경기성 영역, 또는 VZ, 조직을 추출한다.
VZ를 해부하려면 두몬트 집게로 반구 중 하나를 잡고 카우다테 푸타멘을 일렬로 만드는 조직 아래에 두 번째 집게의 미세한 팁을 삽입하십시오. 등쪽 복부 축을 따라 집게를 열어 조직을 분리하고 VZ를 냉세척 용액 2밀리리터가 있는 원심분리기 튜브로 수집합니다. 두 개 이상의 동물의 조직을 풀지 마십시오.
다른 반구에서 미세 절을 반복하고 얼음에 조직튜브를 저장합니다. DG를 해부하려면 메스를 사용하여 코로나 절단을 카우달 블록으로 만들고 해마 형성이 관찰되는 두 조각을 얻습니다. Dumont 집게를 사용하여 슬라이스 중 하나를 잡고 다른 집게로 DG와 CA1 사이에 수평 을 잘라냅니다.
그런 다음 DG와 CA3 사이의 수직 절개를 하여 DG를 분리합니다. 첫 번째 슬라이스의 다른 반구에서 해부를 반복한 다음 두 번째 슬라이스의 두 반구에서 해부를 반복합니다. 원심분리기 튜브에 각 볼의 4개의 DG 조각을 수집합니다. 원심분리관을 생물안전 캐비닛 내부에 놓고 조직 파편이 중력에 의해 침전될 때까지 약 10분간 기다립니다.
그런 다음 세척 용액을 제거하고 각 튜브에 따뜻한 효소 용액 1 밀리리터를 추가합니다. 튜브를 37도에서 10분 동안 배양합니다. 조직 조각을 분해하려면 1 밀리리터 팁으로 위아래로 파이펫을 피펫하지만 30 번 이상 파이펫을하지 마십시오.
37섭씨에서 배양을 반복한 다음 조직을 다시 피펫합니다. 각 튜브에 N-2 배지 9밀리리터를 추가하여 효소 처리를 희석시키고 튜브를 4분 동안 200배 g에서 원심분리합니다. 상체를 버리고, N-2 배지의 10 밀리리터로 세포를 씻고, 원심분리를 반복한다.
각 튜브에서 상체를 제거하고 VZ 및 DG의 세포 펠릿을 각각 2밀리리터및 B-27 배지의 1밀리리터로 재보종한다. 40 마이크로미터 세포 스트레이너로 각 세포 현탁액을 필터링하여 소화되지 않는 조직을 제거합니다. 초저 부착 24웰 플레이트에서 여과된 세포를 배양하고, VZ용 2개의 우물과 DG에 대해 1개의 우물을 사용한다. 섬유아세포 성장인자 당 20 나노그램, 표피 성장 인자의 밀리리터당 20나노그램을 각 웰에 추가한 다음, 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 가 48시간 동안 배양합니다.
인큐베이션 후 배양 배지의 절반을 제거하고 신선한 B-27 배지로 대체하여 성장 인자의 이중 농도로 보충합니다. 이 과정을 3일마다 반복합니다. 배양 배지를 변경할 필요가 없는 날에는 1X의 최종 농도에 성장 인자를 추가합니다.
신경구는 미묘 지대에서 분리된 신경 줄기 세포와 여성 및 남성 성인 대초원 voles의 성축 자이러스로부터 형성되었다. 1차 문화에는 파편이 있었지만, 첫 번째 구절 이후에는 신경구만 존재했다. 더 많은 수의 신경구가 남성 지하 구역에서보다 여성 지하 영역에서 얻어졌거나, 암컷과 남성의 성축 자이러스를 얻었으며, 이는 얻어진 신경권의 수가 증식 영역과 볼섹스에 달려 있음을 시사한다.
신경구의 직경은 8일, 11일, 14일에 측정되었다. 그것은 두 신경 영역에서 남성과 여성 voles에 대 한 점진적으로 증가, 하지만 남성 뇌에서 파생 된 신경 구체 는 여성 뇌에서 파생 된 그에 비해 작아졌다. 부착된 신경구는 성장 인자가 있는 6일째, 또는 15일째에 성장 인자 없이 특징지어졌습니다.
6일째, 미분화 된 조건에서, 신경권 유래 세포는 신경 전구를 위한 마커인 네신을 발현했습니다. 또한 이중 코르틴 양성 세포와 증식 마커 Ki-67을 식별할 수 있었는데, 이는 뉴런 전구체 또는 미성숙 뉴런의 존재를 나타낸다. 그러나, DCX와 Ki-67의 colocalization의 부족은 포스트 미토틱 신경 폭발의 존재를 제안했다.
15일째, 분화 조건 하에서, 교아세포 표현형을 가진 성숙한 뉴런 및 세포가 발견되어, 고립된 세포의 분화 잠재력을 입증하였다. 이 프로토콜을 시도할 때, 마이크로 절부에서 인식할 수 있고 이전 사례를 갖는 것은 신경질적인 틈새에서 세포만 격리하는 것이 기본이라는 것을 명심하십시오. 이 프로토콜에 따라, 실험은 신경 줄기 및 선구 세포의 증식, 분화 및 생존에 관여하는 메커니즘을 식별하도록 설계 될 수있다, 대초원 vole에서 아직 알려지지 않은 프로세스.
