Этот метод может помочь исследовать секс-зависимые различия в нейрогенных нишах, и понять их нейропластичность, изменения, которые подчеркивают социальные взаимодействия в прерии vole. Анализ нейросфер является отличным инструментом для определения пролиферации и дифференциации потенциала нервных стволовых клеток и клеток-предшественников. Для начала поместите чашку Петри на поверхность, окруженную льдом.
Депозит мозга на блюдо и добавить 20 миллилитров холодного раствора мытья. В корональной плоскости, разделить мозг на два блока ткани с помощью скальпеля, выполняя разрез на уровне брегмы в передней-задней оси. Извлекайте субвентрикулярную зону, или ВЗ, ткань из рострального блока, и изморозка из хвостовой извилины, или ГД, из хвостового блока.
Чтобы вскрыть ВЗ, удерживайте одно из полушарий с помощью типса Дюмона и вставьте тонкие кончики второго типса под тканью, высовываемой каудат-путамен. Откройте типсы вдоль спинной вентральной оси, чтобы отделить ткань, и соберите V в центрифугу трубку с двумя миллилитров холодного раствора мытья. Не объединить ткани более двух животных.
Повторите микропересмешку в другом полушарии и храните трубку с тканью на льду. Чтобы вскрыть ГД, используйте скальпель, чтобы сделать корональный разрезать на хвостовой блок, чтобы получить два ломтика, в которых гиппокампа образование наблюдается. Используйте типсы Dumont, чтобы держать один из ломтиков, и сделать горизонтальный разрез между DG и CA1 с другой типсов.
Затем сделайте вертикальный разрез между DG и CA3, чтобы отделить DG. Повторите вскрытие в другом полушарии первого ломтика, затем в обоих полушариях во втором ломтике. Соберите четыре ГД штук каждого vole в центрифуге трубки. Поместите центрифуги труб внутри шкафа биобезопасности и ждать около 10 минут для фрагментов ткани, чтобы осаждать под действием силы тяжести.
Затем снимите раствор для мытья и добавьте по миллилитр теплого энзиматичного раствора в каждую трубку. Инкубировать трубки при 37 градусах в течение 10 минут. Чтобы распасть фрагменты ткани, пипетки их вверх и вниз с одним миллилитровым кончиком, но не пипетки более 30 раз.
Повторите инкубацию при 37 градусах по Цельсию, а затем пипетку ткани снова. Добавьте девять миллилитров N-2 среды к каждой трубке, чтобы разбавить энзиматической обработки, и центрифуга труб при 200 раз g в течение четырех минут. Откажитесь от супернатанта, вымойте клетки 10 миллилитров среды N-2 и повторите центрифугу.
Удалите супернатант из каждой трубки и повторно посовелите клеточные гранулы ВЗ и ГД в два миллилитров и один миллилитр среды B-27, соответственно. Фильтр каждой клетки подвески с 40 микрометровых клеток ситечко, чтобы удалить любые непереваренные ткани. Культура фильтрованных ячеек в ультра-низком крепление 24-хорошо пластины, используя две скважины для ВЗ и один хорошо для ГД. Добавьте 20 нанограмм на миллилитр фактора роста фибробластов 2 и 20 нанограмм на миллилитр эпидермального фактора роста к каждой пластине, затем инкубировать пластину при 37 градусах цельсия, 5%углекислом газе и высокой влажности в течение 48 часов.
После инкубации удалите половину среды культуры и замените ее свежей средой B-27, дополненной двойными концентрациями факторов роста. Повторяйте этот процесс каждый третий день. В дни, когда нет необходимости менять культурную среду, добавьте факторы роста к конечной концентрации 1X.
Нейросферы были сформированы из нервных стволовых клеток, изолированных от субвентрикулярной зоны и зубной извилины как женщин, так и мужчин взрослых прерий voles. Хотя в первичной культуре был мусор, после первого прохода присутствовали только нейросферы. Большее количество нейросфер было получено из женской субвентрикулярной зоны, чем из мужской субвентрикулярной зоны, или зубной извилины как женщин, так и мужчин, что свидетельствует о том, что количество полученных нейросфер зависит от зоны пролиферации и vole sex.
Диаметр нейросфер измерялся в дни 8, 11 и 14. Он постепенно увеличивался для мужских и женских voles в обоих нейронных регионах, но нейросферы, полученные из мужского мозга были меньше по сравнению с теми, которые получены из женского мозга. Прилипаемые нейросферы характеризовались на шестой день наличием факторов роста, или на 15-й день без факторов роста.
На шестой день, в недифференцированных условиях, нейросферные клетки выразили Nestin, маркер для нейронных прародителей. Также удалось определить двойные маркерин-положительные клетки и маркер пролиферации Ki-67, которые указывают на наличие либо нейрональных прекурсоров, либо незрелых нейронов. Однако отсутствие колокализации Ки-67 с DCX свидетельствует о наличии постмитотических нейробластов.
В день 15, в условиях дифференциации, зрелые нейроны и клетки с глиальным фенотипом были найдены, демонстрируя потенциал дифференциации изолированных клеток. При попытке этого протокола, имейте в виду, что возможность распознавать и иметь предыдущую практику в микропересмешении имеет основополагающее значение для изоляции только клетки из нейрогенных ниш. Следуя этому протоколу, эксперименты могут быть разработаны для выявления механизмов, участвующих в распространении, дифференциации и выживании нервных стволовых клеток и клеток-предшественников, процессов, которые до сих пор неизвестны в прерии vole.
