この方法は、神経原性ニッチの性依存性に依存する違いを調査し、その神経可塑性を理解するのに役立ちます, 大草原の社会的相互作用を強調する変化.神経球のアッセイは、神経幹および前駆細胞の増殖および分化の可能性を決定するための優れたツールである。まず、氷に囲まれた表面にペトリ皿を置きます。
皿に脳を堆積させ、冷たい洗浄液の20ミリリットルを加える。コロナ平面では、メスを使用して脳を2つの組織ブロックに分け、前部後軸のブレグマレベルで切断を行う。耳下皮領域、またはVZ、ロストラルブロックから組織、および歯状回、またはDG、尾骨ブロックから組織を抽出する。
VZを解剖するには、デュモン鉗子で半球の1つを保持し、コーデートプタメンを並べた組織の下に第2鉗子の細かい先端を挿入する。組織を分離するために、側腹側軸に沿って鉗子を開き、冷たい洗浄液の2ミリリットルで遠心管にVZを集めます。2匹以上の動物の組織をプールしないでください。
他の半球でマイクロディショ切を繰り返し、氷の上に組織とチューブを保存します。DGを解剖するには、メスを使用して尾大ブロックにコロナカットを行い、海馬の形成が観察される2つのスライスを得る。デュモン鉗子を使用してスライスの1つを保持し、DGとCA1の間に別の鉗子で水平に切り取ります。
次いで、DGとCA3との間に垂直切開を行い、DGを分離する。最初のスライスの他の半球で解剖を繰り返し、2番目のスライスの両方の半球で解剖を繰り返します。遠心分離管に各ボレの4つのDG部分を集める。バイオセーフティキャビネット内に遠心管を入れ、組織断片が重力によって沈殿するまで約10分待ちます。
次に、洗浄液を取り出し、各チューブに1ミリリットルの温かい酵素溶液を加えます。37度で10分間チューブをインキュベートします。組織断片を崩壊させるために、ピペットを1ミリリットルの先端で上下にピペットしますが、ピペットは30回以上しないでください。
37°Cでインキュベーションを繰り返し、再び組織をピペットします。各チューブに9ミリリットルのN-2培地を加え、酵素処理を希釈し、チューブを200倍gで4分間遠心分離します。上清を捨て、細胞を10ミリリットルのN-2培地で洗浄し、遠心分離を繰り返します。
各チューブから上澄み液を取り出し、VZ及びDGの細胞ペレットをそれぞれ2ミリリットル及び1ミリリットルのB-27培地に再懸濁する。各細胞懸濁液を40マイクロメートルの細胞ストレーナーでフィルターし、消化されていない組織を除去します。VZ用に2つのウェルを使用し、DGに1つのウェルを使用して、超低添付着24ウェルプレートで濾過された細胞を培養します。線維芽細胞増殖因子2の1ミリリットル当たり20ナノグラム、各ウェルに表皮成長因子の1ミリリットル当たり20ナノグラムを加え、その後、摂氏37度、5%の二酸化炭素、高湿度でプレートを48時間インキュベートする。
インキュベーション後、培養培地の半分を取り除き、新鮮なB-27培地に置き換え、成長因子の二重濃度を補う。このプロセスを 3 日ごとに繰り返します。培養培地を変更する必要がない日には、1Xの最終濃度に成長因子を加える。
神経球は、女性と男性の両方の成人大草原の脳室領域およびデンテート回から分離された神経幹細胞から形成された。一次培養では残骸があったが、最初の通過後に存在したのは神経球だけだった。より多くの神経球が、男性の脳室領域、または女性と男性の両方のデンテート回よりも女性の脳室領域から得られたもので、得られる神経球の数は増殖帯とボレ性に依存することを示唆している。
神経球の直径は8日目、11日目、14日目に測定した。それは両方の神経領域の男性と女性のボルのために徐々に増加したが、男性の脳に由来する神経球は、女性の脳に由来するものと比較して小さかった。付着した神経球は、成長因子の存在下で6日目、または成長因子なしで15日目に特徴付けられる。
6日目、未分化状態の下で、神経球由来細胞は神経前駆細胞のマーカーであるネスチンを発現した。また、ニューロン前駆体または未熟なニューロンの存在を示すダブルコルチン陽性細胞および増殖マーカーKi-67を同定することも可能であった。しかし、DCXによるKi-67の共局在化の欠如は、ポストミトティック神経芽細胞の存在を示唆した。
15日目に、分化条件下で、グリア表現型を有する成熟したニューロンおよび細胞が発見され、単離された細胞の分化電位を示した。このプロトコルを試みるとき、 マイクロディショニングにおける以前の練習を認識し、持つことが神経原性ニッチから細胞だけを単離する基本であることに留意してください。このプロトコルに従って、実験は、増殖、分化および神経幹細胞および前駆細胞の生存に関与するメカニズムを同定するために設計することができ、大草原の中ではまだ知られていないプロセスである。
