Este método pode ajudar a investigar diferenças dependentes do sexo nos nichos neurogênicos, e a entender sua neuroplasticidade, mudanças que sublinham as interações sociais no vole da pradaria. O ensaio das neurosferas é uma excelente ferramenta para determinar o potencial de proliferação e diferenciação das células neurais e progenitoras. Para começar, coloque uma placa de Petri em uma superfície cercada de gelo.
Deposite o cérebro no prato e adicione 20 mililitros de solução de lavagem a frio. No plano coronal, divida o cérebro em dois blocos de tecido usando um bisturi, realizando o corte ao nível de bregma no eixo anterior-posterior. Extrair a zona subventricular, ou VZ, tecido do bloco rostral, e o giro dentado, ou DG, tecido do bloco caudal.
Para dissecar o VZ, segure um dos hemisférios com um fórceps Dumont, e insira as pontas finas de um segundo fórceps sob o tecido que reveste o caudate-putamen. Abra os fórceps ao longo do eixo dorsal-ventral para separar o tecido, e colete o VZ em um tubo de centrífuga com dois mililitros de solução de lavagem fria. Não acumule o tecido de mais de dois animais.
Repita a microdisseção no outro hemisfério e armazene o tubo com o tecido no gelo. Para dissecar o DG, use um bisturi para fazer um corte coronal no bloco caudal, para obter duas fatias nas quais a formação hipocampal é observada. Use fórceps Dumont para segurar uma das fatias e faça um corte horizontal entre DG e CA1 com outro fórceps.
Em seguida, faça uma incisão vertical entre o DG e o CA3, para separar o DG. Repita a dissecção no outro hemisfério da primeira fatia, depois em ambos os hemisférios na segunda fatia. Colete os quatro pedaços de DG de cada vole em um tubo de centrífuga. Coloque os tubos de centrífugas dentro do armário de biossegurança e espere aproximadamente 10 minutos para que os fragmentos de tecido precipitam pela gravidade.
Em seguida, remova a solução de lavagem e adicione um mililitro de solução enzimática quente a cada tubo. Incubar os tubos a 37 graus por 10 minutos. Para desintegrar os fragmentos de tecido, pipeta-os para cima e para baixo com uma ponta de um mililitro, mas não pipeta mais de 30 vezes.
Repita a incubação a 37 graus Celsius e depois encote o tecido novamente. Adicione nove mililitros de meio N-2 a cada tubo para diluir o tratamento enzimático e centrifugar os tubos a 200 vezes g durante quatro minutos. Descarte o supernasce, lave as células com 10 mililitros de meio N-2 e repita a centrifugação.
Remova o supernatante de cada tubo e resuspenja as pelotas celulares do VZ e DG em dois mililitros e um mililitro do meio B-27, respectivamente. Filtre cada suspensão celular com um coador de células de 40 micrômetros para remover qualquer tecido não digerido. Cultume as células filtradas em uma placa de 24 poços de fixação ultra-baixa, usando dois poços para o VZ e um bem para o DG. Adicione 20 nanogramas por mililitro do fator de crescimento do fibroblasto 2, e 20 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico a cada poço, em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e alta umidade por 48 horas.
Após a incubação, remova metade do meio de cultura e substitua-o por meio B-27 fresco, complementado com duplas concentrações dos fatores de crescimento. Repita esse processo a cada três dias. Nos dias em que não é necessário mudar o meio de cultura, adicione fatores de crescimento a uma concentração final de 1X.
As neurosferas foram formadas a partir das células-tronco neurais isoladas da zona subventricular e do giro dento de ambos os voles da pradaria adulta feminina e masculina. Embora houvesse detritos na cultura primária, apenas as neurosferas estavam presentes após a primeira passagem. Um maior número de neurosferas foram obtidas da zona subventricular feminina do que da zona subventricular masculina, ou do giro dentado de fêmeas e machos, sugerindo que o número de neurosferas obtidas depende da zona proliferativa e do sexo de vole.
O diâmetro das neurosferas foi medido nos dias 8, 11 e 14. Aumentou progressivamente para os voles masculinos e femininos em ambas as regiões neuronais, mas as neurosferas derivadas dos cérebros masculinos eram menores em comparação com as derivadas dos cérebros femininos. As neurosferas aderidas foram caracterizadas no sexto dia na presença de fatores de crescimento, ou no dia 15 sem fatores de crescimento.
No sexto dia, sob condições indiferenciadas, as células derivadas da neurosfera expressaram Nestin, um marcador para progenitores neurais. Também foi possível identificar células doublecortin-positivas e o marcador de proliferação Ki-67, que indicam a presença de precursores neuronais ou neurônios imaturos. No entanto, a falta de colocalização do Ki-67 com DCX sugeriu a presença de neuroblastos pós-mitóticos.
No dia 15, em condições de diferenciação, foram encontrados neurônios maduros e células com o fenótipo gliano, demonstrando o potencial de diferenciação das células isoladas. Ao tentar esse protocolo, tenha em mente que ser capaz de reconhecer e ter prática prévia em microdisseção é fundamental para isolar apenas as células dos nichos neurogênicos. Seguindo este protocolo, os experimentos podem ser projetados para identificar mecanismos envolvidos na proliferação, diferenciação e sobrevivência de células-tronco neurais e progenitoras, processos que ainda são desconhecidos no vole da pradaria.
