תרבות הנוירוספירות הנגזרות מהנישות הנוירוגניות בערבה בוגרת וול

שיטה זו יכולה לעזור לחקור הבדלים תלויי מין בנישות הנוירוגניות, ולהבין את הנוירופלסטיות שלהם, שינויים המ מדגישים אינטראקציות חברתיות בערבה vole. ההתזה של נוירוספרות היא כלי מצוין כדי לקבוע את פוטנציאל התפשטות והתברואה של גזע עצבי ותאי צאצא. כדי להתחיל, מניחים צלחת פטרי על משטח מוקף קרח.

להפקיד את המוח על המנה ולהוסיף 20 מיליליטר של פתרון לשטוף קר. במישור הקורונה, מחלקים את המוח לשני גושי רקמה באמצעות אזמל, ומבצעים את החתך ברמת ברגמה בציר הקדמי-אחורי. לחלץ את אזור subventricular, או VZ, רקמה מבלוק rostral, ואת gyrus dentate, או DG, רקמה מבלוק caudal.

כדי לנתח את VZ, להחזיק את אחת ההמיספרות עם מדפים Dumont, ולהכניס את קצות דק של מדפים השני מתחת לרקמה כי קווי caudate-putamen. פתח את המדפים לאורך הציר הגבי-גחוני כדי להפריד את הרקמה, ולאסוף את VZ לתוך צינור צנטריפוגה עם שני מיליליטר של פתרון לשטוף קר. אין לאסוף את הרקמה של יותר משני בעלי חיים.

חזור על המיקרו-דיסקטוריה בחצי הכדור השני ואחסן את הצינור עם הרקמה על הקרח. כדי לנתח את DG, להשתמש באזמל כדי להפוך את קורנל לחתוך לתוך בלוק caudal, כדי לקבל שתי פרוסות שבהן היווצרות ההיפוקמפוס הוא ציין. השתמש מדפים Dumont להחזיק את אחת הפרוסות, ולעשות חתך אופקי בין DG ו CA1 עם מדפים אחרים.

לאחר מכן, בצע חתך אנכי בין ה- DG ל- CA3, כדי להפריד את ה- DG. חזור על הניתוח בחצי הכדור השני של הפרוסה הראשונה, ולאחר מכן בשתי ההמיספרות בפרוסה השנייה. לאסוף את ארבעת חתיכות DG של כל נברן בצינור צנטריפוגה. מניחים את צינורות הצנטריפוגה בתוך ארון biosafety ולחכות כ 10 דקות עבור שברי הרקמה לזרז על ידי כוח הכבידה.

לאחר מכן, להסיר את פתרון לשטוף ולהוסיף מיליליטר אחד של פתרון אנזימטי חם לכל צינור. דגירה הצינורות ב 37 מעלות במשך 10 דקות. כדי לפורר את שברי הרקמה, פיפטה אותם למעלה ולמטה עם קצה מיליליטר אחד, אבל לא pipette יותר מ 30 פעמים.

חזור על הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס, ואז פיפטה הרקמה שוב. מוסיפים תשעה מיליליטר של N-2 בינוני לכל צינור כדי לדלל את הטיפול האנזימטי, וצנטריפוגה הצינורות ב 200 פעמים גרם במשך ארבע דקות. השליכו את העל-טבעי, שטפו את התאים ב-10 מיליליטר של מדיום N-2, וחזרו על הצנטריפוגה.

מוציאים את העל-טבעי מכל צינור, ומוציאים מחדש את כדורי התא של ה-VZ וה-DG בשני מיליליטר ומיליליטר אחד של מדיום B-27, בהתאמה. סנן כל מתלה תא עם מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר כל רקמה שאינה מתעכלת. תרבות התאים המסוננים בצלחת קובץ מצורף אולטרה נמוך 24 באר, באמצעות שתי בארות עבור VZ ואחד גם עבור DG. הוסף 20 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה fibroblast 2, ו 20 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה אפידרמיס לכל באר, ולאחר מכן להדק את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס, 5%פחמן דו חמצני, ולחות גבוהה במשך 48 שעות.

לאחר הדגירה, להסיר מחצית מדיום התרבות ולהחליף אותו עם טרי B-27 בינוני, בתוספת ריכוזים כפולים של גורמי הגדילה. חזור על תהליך זה כל יום שלישי. בימים שבהם אין צורך לשנות את מדיום התרבות, להוסיף גורמי גדילה לריכוז הסופי של 1X.

נוירוספרות נוצרו מתאים גזע עצביים מבודדים מן האזור subventricular ו gyrus שקע של ערבה נקבה וזכר שניהם. למרות שהיו פסולת בתרבות העיקרית, רק נוירוספרות היו נוכחים לאחר הקטע הראשון. מספר גבוה יותר של נוירוספרות התקבלו באזור חדר המשנה הנשי מאשר באזור התת-חדרי הגברי, או gyrus שקע של נקבות וזכרים, מה שמרמז כי מספר הנוירוספרות שהושגו תלוי באזור ההתפשטות ואת המין vole.

קוטר הנוירוספרות נמדד בימים 8, 11 ו-14. הוא גדל בהדרגה עבור נברנים זכריים ונקדיים בשני האזורים העצביים, אך הנוירוספרות הנגזרות מהמוח הגברי היו קטנות יותר בהשוואה לאלה הנגזרות מהמוח הנשי. נוירוספרות דבק התאפיינו ביום השישי בנוכחות גורמי גדילה, או ביום 15 ללא גורמי גדילה.

ביום השישי, בתנאים בלתי מוגנים, התאים המופקים מהנוירוספרה ביטאו את נסטין, סמן לאוהדים עצביים. ניתן היה גם לזהות תאים חיוביים כפוליקורטין ואת סמן התפשטות Ki-67, אשר מצביעים על נוכחות של מבשרי עצב או נוירונים לא בוגרים. עם זאת, חוסר colocalization של Ki-67 עם DCX הציע את נוכחותם של נוירובלסטים פוסט מיוטיים.

ביום ה -15, בתנאי התברואה, נמצאו נוירונים בוגרים ותאים עם פנוטיפ גליה, המדגימים את פוטנציאל ההידול של התאים המבודדים. כאשר מנסים פרוטוקול זה, יש לזכור כי היכולת לזהות שיש תרגול קודם במיקרו-דיסקטיות היא היסוד לבודד רק תאים מן הנישות הנוירוגניות. בעקבות פרוטוקול זה, ניסויים יכולים להיות מתוכננים לזהות מנגנונים המעורבים התפשטות, התביור והישרדות של גזע עצבי ותאי אבי, תהליכים שעדיין לא ידועים בערבה vole.