Bu yöntem nörojenik nişlerde cinsiyete bağlı farklılıkları araştırmak için yardımcı olabilir, ve onların nöroplastisite anlamak için, çayır vole sosyal etkileşimleri vurgulamak değişiklikler. Nörosferlerin tsay nöral kök ve progenitor hücrelerinin çoğalma ve farklılaşma potansiyelini belirlemek için mükemmel bir araçtır. Başlamak için, buz la çevrili bir yüzeye bir Petri kabı yerleştirin.
Çanak üzerinde beyin mevduat ve soğuk yıkama çözeltisi 20 mililitre ekleyin. Koronal düzlemde, ön-posterior ekseninde bregma düzeyinde kesme gerçekleştiren, bir neşter kullanarak doku iki blok halinde beyin bölün. Subventriküler zonu veya VZ, rostral blok doku ayıklayın ve dentat girus, ya da DG, kaudal blok doku.
VZ incelemek için, bir Dumont forceps ile yarımkürede birini tutun, ve kaudate-putamen hatları doku altında ikinci bir forceps ince uçlarını yerleştirin. Dokuyu ayırmak için dorsal-ventral eksen boyunca forsepsleri açın ve VZ'yi iki mililitre soğuk yıkama çözeltisi içeren bir santrifüj tüpüne toplayın. İkiden fazla hayvanın dokusunu birleştirmeyin.
Diğer yarımküredeki mikrodiseksiyonu tekrarlayın ve tüpü dokuyla buz üzerinde saklayın. DG incelemek için, bir koronak kesim kaudal blok yapmak için bir neşter kullanın, hangi hipokampal oluşumu gözlenen iki dilim elde etmek için. Dilimlerden birini tutmak için Dumont forceps'u kullanın ve DG ve CA1 arasında başka bir çeliş lekesi ile yatay bir kesim yapın.
Daha sonra, DG ve CA3 arasında dikey bir kesi yapmak, DG ayırmak için. İlk dilimin diğer yarımküresinde diseksiyonu, ikinci dilimin her iki yarımküresinde tekrarlayın. Bir santrifüj tüp her vole dört DG parçaları toplamak. Santrifüj tüplerini biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin ve doku parçalarının yer çekimine göre çökeltmesini yaklaşık 10 dakika bekleyin.
Daha sonra, yıkama çözeltisini çıkarın ve her tüpe bir mililitre sıcak enzimatik çözelti ekleyin. Tüpleri 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Doku parçalarını parçalamak için, pipet bir mililitre ucu ile yukarı ve aşağı, ama daha fazla 30 kez pipet yok.
Kuluçkayı 37 santigrat derecede tekrarlayın, sonra dokuyu tekrar pipetleyin. Enzimatik tedaviyi seyreltmek için her tüpe dokuz mililitre N-2 orta ekleyin ve tüpleri 200 kez g'de dört dakika santrifüj edin. Supernatant atın, N-2 orta 10 mililitre ile hücreleri yıkayın ve santrifüj tekrarlayın.
Her tüpten supernatant çıkarın ve iki mililitre ve B-27 orta bir mililitre VZ ve DG hücre pelet leri resuspend, sırasıyla. Sindirilmemiş dokuları çıkarmak için her hücre süspansiyonuna 40 mikrometrelik bir süzgeç uygulayın. Kültür vz için iki kuyu ve DG için bir kuyu kullanarak, ultra-düşük eki 24-iyi plaka filtrelenmiş hücreleri. Fibroblast büyüme faktörü 2 mililitre başına 20 nanogram ekleyin, ve epidermal büyüme faktörü mililitre başına 20 nanogram her kuyuya, sonra 37 santigrat derece, 5% karbondioksit ve 48 saat boyunca yüksek nem plaka kuluçka.
Kuluçkadan sonra, kültür ortamının yarısını çıkarın ve büyüme faktörlerinin çift konsantrasyonları ile desteklenen taze B-27 ortamı ile değiştirin. Bu işlemi her üç günde bir tekrarlayın. Kültür ortamını değiştirmenin gerekli olmadığı günlerde, büyüme faktörleri 1X'lik son konsantrasyona ekleyin.
Nörosferler subventriküler bölgeden izole edilen nöral kök hücrelerden ve hem dişi hem de erkek erişkin çayır sıçanlarının dentat girusundan oluşmuştur. Birincil kültürde enkaz olmasına rağmen, ilk geçişten sonra sadece nörosferler mevcuttu. Kadın subventriküler bölgesinden erkek subventriküler zonundan veya hem dişilerin hem de erkeklerin dentat girusundan daha fazla sayıda nörosfer elde edilebilmektedir, bu da elde edilen nörokürelerin sayısının proliferatif bölgeye ve vole cinsiyetine bağlı olduğunu düşündürmektedir.
Nörosferlerin çapı 8, 11 ve 14. Her iki nöronal bölgede de erkek ve dişi sıçanlarda giderek artmış, ancak erkek beyinlerinden elde edilen nörosferler kadın beyinlerinden elde edilenlere göre daha küçüktü. Bağlı nörosferler büyüme faktörlerinin varlığında altıncı günde veya büyüme faktörleri olmadan 15.
Altıncı günde, farklılaşmamış koşullar altında, nörosferden türetilmiş hücreler, nöral atalar için bir belirteç olan Nestin'i ifade etti. Ayrıca çift kortin-pozitif hücreleri ve nöronal öncüllerin veya olgunlaşmamış nöronların varlığını gösteren proliferasyon belirteci Ki-67'yi tanımlamak da mümkün oldu. Ancak, DCX ile Ki-67 kolokalizasyon eksikliği post-mitotik nöroblastlar varlığını önerdi.
15. günde, farklılaşma koşulları altında, izole hücrelerin farklılaşma potansiyelini gösteren, glial fenotip ile olgun nöronlar ve hücreler bulundu. Bu protokolü denerken, mikrodisze'yi tanıyabilmek ve daha önce uygulamaya sahip olmak nörojenik nişlerden sadece hücreleri izole etmek için temel bir temeldir. Bu protokolü takiben, nöral kök ve ata hücrelerinin çoğalması, farklılaşması ve hayatta kalması, çayır sıçanında hala bilinmeyen süreçler ile ilgili mekanizmaları belirlemek için deneyler tasarlanabilir.
