Questo metodo può aiutare a indagare le differenze dipendenti dal sesso nelle nicchie neurogeniche e a comprenderne la neuroplasticità, cambiamenti che sottolineano le interazioni sociali nell'arvicola della prateria. Il dosaggio delle neurosfere è uno strumento eccellente per determinare il potenziale di proliferazione e differenziazione delle cellule staminali neurali e progenitrici. Per iniziare, posizionare una piastra di Petri su una superficie circondata da ghiaccio.
Depositare il cervello sul piatto e aggiungere 20 millilitri di soluzione di lavaggio a freddo. Nel piano coronale, dividere il cervello in due blocchi di tessuto usando un bisturi, eseguendo il taglio a livello di bregma nell'asse anteriore-posteriore. Estrarre il tessuto della zona subventricolare, o VZ, dal blocco rostrale e il giro dentato, o DG, dal blocco caudale.
Per sezionare la VZ, tenere uno degli emisferi con una forza di Dumont, e inserire le punte sottili di una seconda forza sotto il tessuto che linee il caudato-putamen. Aprire le forcep lungo l'asse dorsale-ventrale per separare il tessuto e raccogliere la VZ in un tubo di centrifuga con due millilitri di soluzione di lavaggio a freddo. Non mettere in comune il tessuto di più di due animali.
Ripetere la microdisezione nell'altro emisfero e conservare il tubo con il tessuto sul ghiaccio. Per sezionare la DG, usa un bisturi per fare un taglio coronale nel blocco caudale, per ottenere due fette in cui si osserva la formazione ippocampale. Utilizzare le forcep Dumont per contenere una delle fette e fare un taglio orizzontale tra DG e CA1 con un'altra forza.
Quindi, fare un'incisione verticale tra la DG e CA3, per separare la DG. Ripetere la dissezione nell'altro emisfero della prima fetta, quindi in entrambi gli emisferi nella seconda fetta. Raccogli i quattro pezzi DG di ogni arvicola in un tubo di centrifuga. Posizionare i tubi di centrifuga all'interno dell'armadio di biosicurezza e attendere circa 10 minuti che i frammenti di tessuto precipitino per gravità.
Quindi, rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere un millilitro di soluzione enzimatica calda a ciascun tubo. Incubare i tubi a 37 gradi per 10 minuti. Per disintegrare i frammenti di tessuto, pipettarli su e giù con una punta di millilitro, ma non pipettare più di 30 volte.
Ripetere l'incubazione a 37 gradi Celsius, quindi pipettare di nuovo il tessuto. Aggiungere nove millilitri di mezzo N-2 a ciascun tubo per diluire il trattamento enzimatico e centrifugare i tubi a 200 volte g per quattro minuti. Scartare il supernatante, lavare le cellule con 10 millilitri di mezzo N-2 e ripetere la centrifugazione.
Rimuovere il supernatante da ogni tubo e rimescolare i pellet cellulari del VZ e della DG rispettivamente in due millilitri e un millilitro del mezzo B-27. Filtrare ogni sospensione cellulare con un filtro cellulare da 40 micrometri per rimuovere qualsiasi tessuto non digerito. Coltura delle celle filtrate in una piastra di fissaggio ultra-bassa da 24 pozzi, utilizzando due pozzi per il VZ e un pozzo per la DG. Aggiungere 20 nanogrammi per millilitro del fattore di crescita dei fibroblasti 2 e 20 nanogrammi per millilitro del fattore di crescita epidermico ad ogni pozzo, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e alta umidità per 48 ore.
Dopo l'incubazione, rimuovere metà del mezzo di coltura e sostituirlo con un mezzo B-27 fresco, integrato con doppie concentrazioni dei fattori di crescita. Ripeti questo processo ogni tre giorni. Nei giorni in cui non è necessario cambiare il mezzo di coltura, aggiungere fattori di crescita a una concentrazione finale di 1X.
Le neurosfere erano formate dalle cellule staminali neurali isolate dalla zona subventricolare e dentano il giro delle arvicole della prateria adulta sia femminile che maschile. Sebbene ci fossero detriti nella cultura primaria, solo le neurosfere erano presenti dopo il primo passaggio. Un numero maggiore di neurosfere sono state ottenute dalla zona subventricolare femminile che dalla zona subventricolare maschile, o dal giro dentato sia delle femmine che dei maschi, suggerendo che il numero di neurosfere ottenute dipende dalla zona proliferativa e dal sesso arvicolare.
Il diametro delle neurosfere è stato misurato nei giorni 8, 11 e 14. È aumentato progressivamente per le arvicole maschili e femminili in entrambe le regioni neuronali, ma le neurosfere derivate dal cervello maschile erano più piccole rispetto a quelle derivate dal cervello femminile. Le neurosfere aderenti sono state caratterizzate il sesto giorno in presenza di fattori di crescita o il giorno 15 senza fattori di crescita.
Al sesto giorno, in condizioni indifferenziate, le cellule derivate dalla neurosfera espressero Nestin, un marcatore per i progenitori neurali. È stato anche possibile identificare le cellule positive alla doppiacortina e il marcatore di proliferazione Ki-67, che indicano la presenza di precursori neuronali o neuroni immaturi. Tuttavia, la mancanza di colocalizzazione del Ki-67 con DCX suggerì la presenza di neuroblasti post-mitotici.
Al giorno 15, in condizioni di differenziazione, sono stati trovati neuroni maturi e cellule con il fenotipo gliale, dimostrando il potenziale di differenziazione delle cellule isolate. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che essere in grado di riconoscere e avere una pratica precedente nella microdisezione è fondamentale per isolare solo le cellule dalle nicchie neurogeniche. Seguendo questo protocollo, gli esperimenti possono essere progettati per identificare i meccanismi coinvolti nella proliferazione, differenziazione e sopravvivenza delle cellule staminali neurali e progenitrici, processi che sono ancora sconosciuti nell'arvicola della prateria.
