许多过敏原结合疏水分子。该协议能够完全去除和更换这些配体，使我们能够系统地研究它们对结构和免疫原性的影响。使用逆相HPLC，加上热退化，有两个优点。
它去除内源性配体，并有助于溶解配体，以打开否则无法访问的绑定站点。如果我们能确定导致过敏的因素，我们也许能够设计避免这些因素的疗法。许多蛋白质结合脂质配体，这些脂质配体被强烈保留，并可能影响结构和功能。
我们的方法允许系统地研究这些相互作用。许多脂质货物的溶解性和可及性有限，可能会阻碍装载过程。在准备这些配衣时一定要小心，并考虑系统特定的适应的需要。
由于与疏水和不溶性配体一起工作是一些过敏症患者和生物化学家的调整，因此查看样本在不同阶段的外观是有用的。克隆表达和纯化后，将 12 毫升的裂口 Bla g 1 涂抹到离心滤芯单元中，该过滤器单元的分子重量小于 10 千达尔顿，用于在回转桶转子中多次离心，直到总体积降至 2 毫升以下。将产生的浓缩物加载到 250 乘 10 毫米 HPLC 系统上，该系统配备了 C18 反相色谱列，以每分钟 1.5 至 4 毫秒的流速，以 97% 缓冲 A 和 3% 缓冲 B.Elute Bla g 1 等效，使用 280 纳米的荧光吸收来监测优雅过程。
从大约 34 到 40 分钟开始，缓冲 B 浓度高于 74% 收集不超过每个 Bla g 1 分数的 4 毫升。将池中的 Bla g 1 分数引用到玻璃试管中。用石蜡膜盖住管子，用两个孔打孔。
然后，将样品在零下80摄氏度下冷冻一小时，然后使用同化剂干燥由此产生的去脂蛋白样本。为了确定预期的 Bla g 1 产量，在 5 毫升的再折叠缓冲中重新暂停裂解脱脂测试。将混合物加热到含有250毫升水的500毫升烧瓶中，加热至95摄氏度的热板上，搅拌和间歇性漩涡。
将溶液保持在 95 度，30 至 60 分钟，然后让水浴慢慢平衡到室温。溶液冷却后，通过 0.22 微米注射器过滤器将已脱脂的 Bla g 1 脂质混合物通过去除颗粒物，并使用带有 10 千达吨切口的新型离心滤光片将过滤后的蛋白质三次缓冲到 PBS 中，以去除任何残留的游离脂肪酸和有机溶剂。然后，使用标准蛋白质分析分析评估蛋白质浓度，以确定剩余 Bla g 1 单注的预期产量。
要重新组入 Apo-Bla g 1，将 Bla g 1 的别名重新悬挂在每阿里报价的 5 毫升重新折叠缓冲区中，并按演示对样品进行退化。要将 Bla g 1 与磷脂一起装载，将所需的货物加入玻璃试管中 10 毫克，然后溶解在氯仿中，然后蒸发氯仿以产生脂质薄膜。然后，将 PBS 添加到管中，以产生最终的磷脂浓度为 20 毫摩尔。
将磷脂加热到脂质货物的相位过渡温度上方，以补充脂质薄膜和涡流，直到溶液变成多云。然后，根据预期产量，加入磷脂货物，产生相对于 Bla g 1 的 20 倍摩尔过多的配体。悬崖可能形成。
漩涡在使蛋白质退化前混合， 如所示。要确认通过磷-31 NMR去除或装载货物，请使用离心过滤器将样品浓缩到超过 100 微摩尔（如图所示）。如前所述，准备 PBS 缓冲区中已知浓度的参考磷脂样本，并稀释 Bla g 1 末端参考，将胆碱缓冲器与总容量约 600 微升的 1:1 比率稀释。
使用宽带探头获取整理溶解 Bla g 1 样本的一维 31 磷 NMR 光谱和参考磷脂标准， 并将 Bla g 1 31 磷 NMR 光谱与磷脂参考样品获得的光谱进行比较，以确认去除内源性结合的配体和/或根据可见山峰的化学变化对所需配体的结合，然后比较 Bla g 1 光谱的峰值强度和磷脂参考标准的峰值强度，以便确认完全结合的固态测量。使用亲和色色谱，重组的 GST Bla g 1 可以很容易地隔离到高纯度，每升细胞培养产生 2 到 4 毫克的产量。在摄氏四度下用 TEV 蛋白酶进行隔夜孵化足以去除 GST 标签，最终产品产量约为 24 千达吨。
将 Bla g 1 应用于反相 C18 列可产生独特的弹性轮廓，其中两个大峰值为 50% 缓冲 B，第二个大峰值为 75% 缓冲 B.磷-31 NMR 光谱 Apo-Bla g 1 显示无可检测的磷脂。使用已知 DSPC 浓度的参考样本，可以从 NMR 生成标准曲线。将DSPC Bla g 1获得的磷31信号强度与此标准曲线进行比较，可以用来产生每蛋白质脂质的结合性血脂。
Apo 和脂质加载 Bla g 1 的圆形二分法光谱显示 220 和 210 纳米的微型，表示以阿尔法-赫利科为主的结构。圆形二分法基热变性检测也显示α-赫利科二级结构的合作损失，表明折叠球状域。此外，对由此产生的熔化温度的分析显示，nMix配体结合显著增加，与从其天然过敏原源获得的 Bla g 1 一致。
该协议的成功取决于能否克服疏水配体的有限溶解性，以及Bla g 1结合腔的不可接近性。这一程序为免疫学研究（如T细胞增殖检测）奠定了基础，以评估脂质配体对敏感性的影响以及发生这种影响的分子机制。结合此过程与进一步的生物物理检测，我们已经表明，疏水配体的结合增强了Bla g 1的稳定性，对表位生成和过敏的潜在下游影响。
