使用睡美人转座子系统对原代人色素上皮细胞进行基于电穿孔的遗传修饰

该方法证明了使用睡美人转座子系统对原代人色素上皮细胞进行基于电穿孔的转染，这是转基因表达和蛋白质分泌的证据。睡美人转座子系统和电穿孔的结合能够高效转染原代人色素上皮细胞，以及稳定和持续的转基因表达和蛋白质分泌。总体目标是建立一种基于细胞的基因加成疗法，用于治疗视网膜退行性疾病，这需要稳定和持续地分泌治疗活性蛋白。

演示该程序的将是实验室的医疗技术助理Anne Freialdenhoven和Antje Schiefer。为了制备用于原代人RPE细胞电穿孔的质粒DNA，请使用微量分光光度计定量质粒DNA含量，并将浓度调节至10毫摩尔Tris-HCL中的250纳克/微升。将一体积为250纳克/微升SB100X转座酶质粒DNA与16体积250纳克/微升色素上皮衍生因子转座子质粒DNA混合。

将两微升所得血浆混合物加入冰上的无菌1.5毫升安全锁定微量离心管中，并在缓冲管中填充3毫升缓冲液E.然后将管插入移液器站，直到听到咔嗒声，并将转染装置设置为1，100伏，20毫秒脉冲宽度和两个脉冲。准备用于电穿孔的细胞。首先，通过相差显微镜检查原代RPE细胞培养物的形态，以评估其生长和融合度。

在细胞培养箱中用每孔500微升0.05%胰蛋白酶EDTA处理细胞7至15分钟。当细胞分离后，通过离心收集细胞，将细胞重悬于一毫升PBS中，并在每次转染反应中离心1至10倍10至四个细胞等分试样。将沉淀重悬于每管11微升缓冲液R中，并向每个试管中加入2微升制备的质粒混合物。

将转染移液器的头部插入10 μL转染吸头中，直到夹子完全拾取活塞的安装杆，并将细胞和质粒溶液装入转染吸头中。将转染移液器插入移液器站内的缓冲管中，直到听到咔嗒声，然后按开始开始电穿孔过程。转染后，小心地从移液站取出转染移液器，并立即将细胞和质粒溶液移液到细胞培养板的制备孔中。

从RPE细胞培养上清液中纯化his标记的色素上皮衍生因子融合蛋白。首先，使用斜面切割尖端收集每个样品一个 30 微升等分试样的镍 NTA 浆料，并通过离心沉淀镍 NTA 树脂。小心地用200微升One X孵育缓冲液重悬镍NTA树脂，并通过额外的离心沉淀溶液两次。

第二次离心后，小心地用每个样品的40微升Four X孵育缓冲液重悬镍NTA树脂颗粒。接下来将 55 微升一等分试样的预处理镍 NTA 浆液与 260 微升 Four X 孵育缓冲液和 900 微升每个转染的 RPE 细胞培养上清液混合。将混合物在室温下在摇床上孵育60分钟，然后再次沉淀镍NTA树脂混合物。

小心地将沉淀重悬于175微升One X孵育缓冲液中，并将混合物再离心两次。第二次离心后，小心地将镍NTA树脂颗粒重悬于30微升洗脱缓冲液中，在室温下振荡孵育20分钟，然后再次离心样品。然后小心收集上清液并将其与Two X SDS样品缓冲液混合，用于纯化蛋白质的蛋白质血液分析。

从人类供体眼睛分离的培养原代RPE细胞表现出典型的鹅卵石形态，无论供体的年龄，死后分离时间或培养时间如何。短期电脉冲在原代人RPE细胞中的应用。使用毛细管转染系统不会对上皮形态产生不利影响。

转染原代人RPE细胞培养上清液的西方血液分析显示，色素上皮衍生因子分泌水平一致，无需转基因沉默超过500天。正如在连续转染的细胞培养基的代表性西方血液分析中观察到的那样，在转染后21天观察到普遍较高的色素上皮衍生因子分泌率。在追求培养中，长期升高的 PEDF 分泌持续至少 165 天。

此外，基于 ELISA 的定量显示，与相应的非转染对照细胞相比，转染的原代人 RPE 细胞中的总色素上皮衍生因子分泌增加了 20 倍。这一增量在基因表达水平上也得到了证实，在该水平上，总PEDF表达提高了30倍以上。尝试此方案时，重要的是使用其形态对应于体内状态的色素上皮细胞。

另外，请记住将细胞溶液吸入转染尖端，不要有气泡。稳定转染的细胞可用于不同的离体或体内模型，以验证这种基于细胞的基因加法疗法的功能。