评估对流感嗜血杆菌的呼吸道免疫应答

流感嗜血杆菌是各种慢性肺部疾病（包括COPD和肺炎）炎症的主要原因。该协议描述了评估嗜血杆菌对肺部炎症影响的方法。该技术的优点是可以全面评估先天性和适应性免疫反应。

将 450 微升外周血与 50 微升标记为流感嗜血杆菌的活化碘化丙啶在 5 毫升管中在 37 摄氏度的水浴中孵育 20 分钟。从水浴中取出样品，加入五微升DHR并涡旋10秒钟。然后将其放回水浴中再放置 10 分钟。

从水浴中取出样品后，用五毫升0.8%氯化铵溶液裂解红细胞，并如文本中所述在流式细胞仪上分析样品。将外周血样本分成等分试样进行对照和抗原刺激。向两个样品添加共刺激抗体。

然后将非典型流感嗜血杆菌添加到抗原样品中，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育一小时。接下来，将高尔基体封闭剂布雷菲尔丁A添加到样品中，并再孵育五个小时。如前所述裂解红细胞后，使用 500 微升 1% 至 2% 的副甲醛固定白细胞一小时。

使用血细胞计数器计数细胞，然后用100微升0.1%皂苷透化100万个细胞15分钟。接下来，用适当的荧光标记抗体孵育细胞。洗涤细胞，然后使用流式细胞仪进行分析。

通过获取相关的淋巴细胞群来确定抗原反应细胞的比例。对未受刺激的细胞进行背景染色，以分析所有要分析的细胞因子。将大约 20 到 40 克的肺叶切除术样本切成三到五立方毫米的部分。

将它们放入无菌的50微升腔室中，并使用适当的解聚器机械地碎片组织。组织解聚后，如图所示裂解红细胞，并将细胞重悬于无菌RPMI中。然后通过100微米无菌尼龙网过滤细胞，并使用台盼蓝排除方法计数活细胞。

对于感染测定，将肺细胞重悬于RPMI中，最终浓度为每管每毫升400万个细胞。然后以每个细胞100个细菌的MOI感染细胞。松开盖子旋转半圈，以允许气体在管中转移。

将细胞放入试管旋转器中，并在 37 摄氏度下孵育它们，同时以 12 RPM 旋转。刺激后一小时，加入格雷菲尔丁A以防止细胞因子的细胞外输出，并将细胞悬液再孵育16至22小时。第二天，用含有1%牛血清白蛋白和0.01%叠氮化钠的500微升PBS洗涤细胞悬液。

接下来，对细胞悬液染色特定的人淋巴细胞表面标志物一小时。然后用PBS洗涤细胞并如前所述对其进行固定和透化。接下来，用细胞内细胞因子染色抗体孵育细胞一小时。

然后洗涤细胞并将其重悬于100微升PBS中，然后在流式细胞仪上采集数据。通过金属蛋白酶的作用测量蛋白水解，将荧光素标记的明胶底物直接添加到肺组织切片载玻片上。将载玻片水平放置，并在37摄氏度的避光加湿室中孵育一小时。

为了制备阴性对照，向切片中加入一个不含荧光明胶的反应缓冲液以进行进一步分析。使用向前和侧面分散的外周血单核细胞进行门控，以定义吞噬细胞群。吞噬细胞群通过CD14表达进一步定义以标记单核细胞。

通过氧化DHR 123进行ROS测量以产生荧光。将受激发样品的中位数荧光与对照进行比较。使用流式细胞术测量淋巴细胞产生的细胞内细胞因子。

首先分析细胞白细胞标志物CD45的表达，然后分析CD三和CD四，CD八。将CD三、CD四阳性细胞评估对照和刺激样品中细胞内细胞因子的产生情况。在未固定的肺组织切片中通过NC两个酶谱测量蛋白酶活性。

荧光染色表明存在MMP活性，MMP活性也与染色质的表达共定位。向肺组织样品中添加抗体需要浓缩，细胞染色需要在初步实验中进行优化。肺组织样品的上清液可以使用ELISA等技术进一步分析其他炎症介质，这些技术可用于评估潜在疗法对肺部炎症的影响。