伽马射线照射是一种广泛使用的结直肠癌治疗方法。虽然它在治疗上有效，但它对胃肠道有负面影响。所提出的协议描述了一种有效的方法来研究辐射损伤后再生过程中细胞的活化，分化和迁移。
该协议描述了一个稳健且可重复的辐射损伤模型。重要的是，该模型允许跟踪损伤后的肠道细胞命运，从而更好地了解特定细胞亚群的再生能力。该技术可以采用不同的谱系追踪动物模型来研究损伤后细胞各种亚群的实时行为和相互作用。
对该方案的微小修改应允许研究辐射损伤时微生物群与不同上皮、基质和免疫细胞群之间的关系。首先，将他莫昔芬粉末重悬于无菌玉米油中，浓度为每微升30微克。在 30 秒的开关周期内以 60% 的振幅进行超声处理三分钟。
在室温下在黑暗中旋转混合一小时。然后，通过将无菌DMSO添加到EdU粉末中来制备EdU。加入总体积的1/5，慢慢加入剩余体积的无菌超纯水。
完全溶解后，等分并储存在20摄氏度。准备用于组织收集和固定的试剂，例如 70% 乙醇水溶液、冷却至 4 摄氏度的 DPBS、Bouin 固定缓冲液和 10% 缓冲福尔马林。接下来，准备必要的设备，例如小鼠解剖试剂盒，培养皿，连接到10毫升注射器的16号管饲针和组织学盒。
在伽马辐照暴露前两天，准备实验动物注射他莫昔芬。称量每只动物，并计算所需剂量。用70%乙醇消毒腹部区域。
然后，使用连接到 1 毫升注射器的 27 号针头腹膜内注射单剂量他莫昔芬，以诱导 Cre 介导的重组。在接下来的48小时内观察动物以排除潜在的他莫昔芬毒性。48小时后，将动物转移到照射室。
用70%乙醇溶液对伽马辐照器中的样品室进行消毒。将吸收垫和动物放在样品室内。盖上盖子，然后关闭腔室。
对伽马辐照器进行编程，使动物暴露于 12 个灰色全身照射下。然后，将钥匙转到起始位置，然后按开始开始曝光。离开房间进行主动曝光时间。
经过预设时间后，机器将自动停止并开始发出哔哔声。通过将钥匙转到停止位置来关闭机器。打开样品室，取下盖子。
将动物转移到笼子里，并用70%乙醇对样品室进行消毒。将动物转移回传统的住房房间，并在治疗后观察它们的状况。每天监测动物的体重。
在计划的安乐死前三小时，对腹部区域进行消毒，并使用28号胰岛素注射器腹膜内注射100微升EdU储备溶液。对动物实施安乐死后，在照射后的不同时间点收集近端肠。解剖小肠的近端，并去除附着的组织。
使用连接到 10 毫升注射器的 16 号直进纸针用冷 DPBS 冲洗组织，并用 Bouin 的固定缓冲液固定组织。纵向切开肠子，然后使用瑞士卷技术滚动近端肠。将组织置于组织学盒中，置于装有10%缓冲福尔马林的容器中，并在室温下孵育24至48小时。
孵育后，将组织学盒转移到70%乙醇中，并将组织嵌入石蜡中。包埋后，将组织学盒放在冰上至少一小时。然后，使用切片机切割五微米厚的水平切片。
将组织切片转移到加热至45摄氏度的水浴中，并将切片放在带电载玻片上。将载玻片放在架子上在室温下过夜晾干。小肠标本的苏木精和伊红图像显示0小时时肠上皮稳态，随后在凋亡期隐窝隔室内细胞丢失。
随后是再生阶段，其中高度增殖的细胞填充了隐窝，导致第七天进入正常化阶段。EYFP的谱系追踪表明，在体内平衡期间，来自Bmi1阳性储备干细胞的细胞被限制在隐窝内的正四到六位。EdU和Ki-67染色显示假照射小鼠的肠道稳态正常，从活性干细胞延伸到转运扩增区。
在凋亡期，EYFP阳性细胞的数量减少，伴随着辐射损伤引起的增殖细胞的丧失。在再生阶段，观察到储备干细胞的活化和Bmi1阳性细胞的快速增殖。进一步增殖和迁移恢复了肠上皮的完整性。
TUNEL 染色显示，在稳态期间不存在凋亡细胞。在凋亡期后期观察到TUNEL染色增加。在再生阶段，再生隐窝内的TUNEL染色稳步下降，并且在隐窝归一化时几乎不存在。
该技术可以与RNA测序，单细胞RNA测序，荧光激活细胞分选或蛋白质组学分析相结合，以收集有关特定细胞谱系在损伤后肠道再生中的作用的更深入的知识。研究人员可以研究肠道再生中微生物群与上皮、基质和免疫细胞群之间的相互作用，以扩大对肠上皮再生能力的理解。
