小鼠原代视网膜色素上皮细胞的分离

该协议将概述一种成功分离原代小鼠视网膜色素上皮细胞的简单有效的方法。视网膜色素上皮细胞在维持感光细胞和保证视网膜的正常功能方面起着非常重要的作用。我们的实验室一直在分离小鼠原代色素上皮细胞，作为研究外血视网膜屏障和相关疾病（如年龄相关性黄斑变性）的重要工具。

要提取小鼠眼睛，请根据您所在机构批准的方法对小鼠实施道德安乐死，然后将鼠标放在无菌垫上，并通过在眼眶区域按压 5/45 型镊子来诱导眼球突出，然后将镊子移动到眼睛的后部并轻轻拉动以移除眼睛，确保视神经仍然完好无损。使用镊子时，将眼睛浸入含有5%聚维酮碘的2毫升微量离心管中。在室温下孵育眼睛 2 至 3 分钟。

从聚维酮碘中取出眼睛，并将它们放入培养皿中。使用无菌转移移液器时，用汉克斯平衡盐水溶液清洗眼睛，直到聚维酮碘的橙色消失。这大约需要 2 到 3 次洗涤。

将眼睛放在新的培养皿中，并将其浸没在冷完全RPE细胞生长培养基中。从那里，您可以在解剖显微镜下开始解剖。在显微镜下，使用镊子和/或Vannas剪刀拉开或切掉眼外肌中的结缔组织。

然后可以在冷的RPE细胞培养基中保持眼睛一小时。但是，最好在清洁眼球后直接进行下一步。将眼睛转移到含有酶A溶液的2毫升微量离心管中，然后将眼睛在37摄氏度的培养箱内孵育40分钟。

从酶A溶液中取出眼睛，并将它们放入含有酶B溶液的新2毫升微量离心管中，然后将它们放入培养箱中并在37摄氏度下孵育50分钟。从酶B中取出眼睛，将它们放入60毫米培养皿中，浸没并完成RPE细胞生长培养基，然后将眼睛在4摄氏度下孵育30分钟。将培养皿放在解剖显微镜下并开始解剖。

使用M5S镊子和注射器针头在ora seratta部分做一个切口。现在用两个镊子，用一个镊子抓住切口的内部，用另一个镊子抓住角膜。通过拉角膜开始慢慢地从视网膜上撕裂角膜。

一定要以小的增量撕裂，并在去除角膜时向下移动撕裂。这将确保 RPE 将基本保持完整，并且您将获得更干净的撕裂。一旦角膜完全分离，您应该能够看到虹膜和晶状体。

用镊子去除虹膜和晶状体，以保持隔离的纯度。要从 RPE 层中去除神经视网膜，请用一把镊子抓住眼罩的外层，并将第二把镊子的手臂放在 RPE 和神经层之间。从那里，轻轻地将神经视网膜从RPE层拉开或舀开，然后丢弃神经视网膜。

将 RPE 层移动到培养皿上没有碎屑的其他位置。要将 RPE 与脉络膜和巩膜分离，请用 5/45 式镊子轻轻刮擦眼罩内部，以确保 RPE 细胞的分离。RPE细胞在悬浮和完全RPE细胞生长培养基时呈现混浊。

使用3.2毫升无菌转移移液管吸出细胞，并转移到含有完整RPE细胞生长培养基的新15毫升离心管中。细胞可以在室温下以300g离心10分钟。然后，您可以吸出上清液并将沉淀重悬于加热的RPE细胞生长培养基中。

将细胞接种在 100 毫米培养皿上，并在 37 摄氏度和 5% CO 2 下孵育。这些图像显示了第0代和第1代的成功分离，这通过RPE细胞的色素沉着很明显。在第4代，细胞的特征性降低，色素减少，表现出纺锤状外观或变得更坚固，表面积更大。

我们用RPE特异性标记物RPE65和细胞骨架蛋白F-肌动蛋白验证了RPE细胞。我们还通过用穆勒细胞特异性标记物vimentin染色来检查穆勒细胞的潜在污染。该协议是对现有协议的简化改编。

该协议使用大多数研究实验室中可用的材料和相关设备，这将有助于以有效的方式分离原代小鼠RPE细胞。