从特纳综合征（45XO）胎儿细胞生成诱导多能干细胞，用于与该综合征相关的神经功能障碍的下游建模

特纳综合征是一种与完全或部分缺失的X染色体相关的罕见疾病。该综合征的特征是不孕症、身材矮小、心血管疾病和神经认知缺陷。在某些情况下，它会导致胎儿死亡。

虽然非整倍体胎儿的体细胞具有生物学价值，但它们的寿命很短，因此限制了它们在研究中的使用。因此，iPSC的产生是细胞制备非整倍体性状永久保存的有效方法。它们是自我更新的，可以分化成特殊的细胞类型，让人联想到早期胚胎发育。

通过核假体递送非整合的外显体重编程质粒是产生完全重编程和稳定的iPSC的有效且可重复的方法。这种方法也可用于难以编程的细胞。在该协议中，我们描述了iPSCs从胎儿材料中再生的无症状。

将收集的胎儿绒毛膜绒毛转移到无菌培养皿中。用含有1X抗生素抗真菌剂溶液的PBS洗涤几次。通过移液完全去除 PBS。

将1ml胶原酶混合物加入绒毛中，并在37摄氏度下孵育10分钟或直到组织分解。孵育后，通过添加含有10%胎儿牛血清的培养基中和胶原酶。将培养皿的内容物转移到15ml管中。

离心消化物以收集分解的绒毛和释放的细胞。小心地倾析上清液。在T25培养瓶和AmnioMAX培养基中将绒毛与释放的细胞一起分解，并生长直至获得汇合成纤维细胞培养物。

扩增成纤维细胞和培养物，以制备用于后续转染和表征实验的储备。制备含有重编程质粒的碱培养物。根据制造商的说明，使用Midi质粒纯化试剂盒分离质粒。

将每个托盘重新悬浮在适当体积的DNAse RNAse游离水中，以获得每毫升1微克的终浓度。按照制造商的说明，使用ECoR1限制性酶切试剂盒验证质粒。胰蛋白酶消化绒毛绒毛成纤维细胞。

中和，然后离心以收集细胞。倾析上清液，并将细胞重新悬浮在5ml OPTI-MEM中。使用血细胞计数器计数细胞，并取出100万个细胞进行细胞核切除。

离心机得到细胞托盘。使用Amaxa NHDF神经因子试剂盒进行细胞核切除。通过混合试剂盒中提供的0.5 mL补充剂和2.25 mL核因子溶液来制备神经因子试剂。

除去100微升核因子溶液，并向其中加入1微克每个质粒。在此混合物中轻轻重新悬浮100万个细胞。将细胞DNA悬浮液转移到比色皿中，确保样品覆盖比色皿的底部，没有任何气泡。

盖上比色皿，然后插入支架。选择核因子程序D-23以获得高效率，然后应用。从支架中取出比色皿，然后加入 1 mL AmnioMAX 培养基。

使用试剂盒中提供的移液器将内容物轻轻转移到组织培养处理过的培养皿中。将细胞在37摄氏度的加湿二氧化碳培养箱中孵育。将细胞在AmnioMAX培养基中维持10天，然后转移到多能培养基20天。

对于iPSC扩增，使用拉动的玻璃移液器手动解剖在重编程皿中形成的胚胎干细胞样菌落。适当传播 iPSC，每 5 到 7 天按摩一次。iPCSs多能标志物碱性磷酸酶阳性。

通过将iPSC菌落切成小块并将其接种在胚状体培养基中的低附着培养皿中，产生胚胎样体。外胚层分化是通过在外胚层分化培养基中接种第四天的胚状体来诱导的。类似地，中胚层分化是通过在中胚层分化培养基中接种第八天胚体来诱导的。

为了诱导内胚层分化，在内胚层分化培养基的单层中培养iPSCs。在重编程过程中监测成纤维细胞的形态变化。它们表达上皮细胞样形态并形成致密的菌落。

这些细胞还具有高度细胞核与细胞质的比例，这是培养物中多能细胞的典型特征。iPSCs具有45 XO载流子类型，多能性标记OCT4，NANOG，SOX 2，SSEA 4，TRA-1-81和E-CADHERIN呈阳性。对细胞进行染色以形成具有代表性的生殖层标记物。

因此，特纳综合征会出现神经认知缺陷。来自特纳综合症iPSC的神经元可以是一个很好的模型。这是在培养皿中建模的，以了解正常解离特纳综合征的新系列。