متلازمة تيرنر هي حالة نادرة مرتبطة بكروموسوم X مفقود كليا أو جزئيا. تتميز المتلازمة بالعقم وقصر القامة واضطرابات القلب والأوعية الدموية والعيوب العصبية المعرفية. في بعض الحالات، فإنه يسبب وفاة الجنين.
على الرغم من أن الخلايا الجسدية للأجنة الأنوبلوبيد ذات قيمة بيولوجية ، إلا أنها قصيرة الأجل ، مما يحد من استخدامها في البحث. وبالتالي فإن توليد iPSC هو طريقة فعالة لإعداد الخلايا للحفاظ الدائم على الصفات aneuploid. فهي تجدد نفسها ويمكن أن تفرق إلى أنواع الخلايا المتخصصة تذكرنا النمو الجنيني المبكر.
تسليم غير دمج إعادة برمجة البلازميدات episomal من خلال الخيال النووي هو وسيلة فعالة وقابلة للاستنساخ لتوليد iPSC مبرمجة تماما ومستقرة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة على الخلايا التي يصعب برمجتها. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف تجديد iPSCs من مواد الجنين مع أنيوبليود.
نقل الزغب المشيمي الجنيني الذي تم جمعه إلى طبق بيتري معقم. غسله عدة مرات مع برنامج تلفزيوني يحتوي على محلول مضاد للذهان 1X المضادات الحيوية. إزالة برنامج تلفزيوني تماما عن طريق pipetting.
إضافة مزيج كولاجيناز 1 مل إلى الزغب واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو حتى يتفكك النسيج. بعد الحضانة، تحييد الكولاجيناز بإضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنين. نقل محتويات طبق بيتري في أنبوب 15 مل.
الطرد المركزي هضم لجمع الزغب المتفككة والخلايا الصادرة. الديكة العملاقة بعناية. لوحة سيلي تفككت جنبا إلى جنب مع الخلايا الصادرة في قارورة ثقافة T25 ووسائل الإعلام AmnioMAX وتنمو حتى يتم الحصول على ثقافة الخلايا الليفية التقاء.
توسيع الخلايا الليفية والثقافة لإعداد المخزونات لاستخدامها في التجارب اللاحقة عبر العدوى والتوصيف. إعداد ثقافات القلويات التي تحتوي على إعادة برمجة البلازميدات. عزل البلازميدات باستخدام عدة تنقية ميدي بلازميد، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
إعادة تعليق كل منصة في حجم مناسب من المياه مجانا DNAse RNAse للحصول على تركيز نهائي من 1 ميكروغرام لكل ملليلتر. تحقق من البلازميدات باستخدام مجموعة هضم تقييد ECoR1 ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. جرب الخلايا الليفية التشوريونية.
تحييد، والطرد المركزي لجمع الخلايا. decant supernatant، وإعادة تعليق الخلايا في 5 مل OPTI-MEM. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم، وإزالة 1 مليون خلية للنواة.
الطرد المركزي للحصول على البليت الخلية. إجراء النيوكليوفين باستخدام Amaxa NHDF Neucleofactor كيت. إعداد كاشف نيوكليوكتور عن طريق خلط 0.5 مل الملحق و 2.25 مل حل النوى المقدمة في عدة.
إزالة 100 ميكرولتر من محلول النوى، وإضافة 1 ميكروغرام من كل بلازميد إليها. بلطف إعادة تعليق 1 مليون خلية في هذا المزيج. نقل تعليق الحمض النووي الخلية إلى cuvette، وضمان أن العينة تغطي الجزء السفلي من cuvette دون أي فقاعات الهواء.
قم بوضع غطاء للكوفيت، وأدخله في الحامل. حدد برنامج النوى D-23 لتحقيق كفاءة عالية، وتطبيق. إزالة cuvette من حامل، وإضافة 1 مل من وسائل الإعلام AmnioMAX.
نقل محتويات بلطف في زراعة الأنسجة تعامل طبق بيتري، وذلك باستخدام ماصة المقدمة في عدة. احتضان الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرطبة في 37 درجة مئوية. الحفاظ على الخلايا في وسائل الإعلام AmnioMAX لمدة 10 أيام، ومن ثم التحول إلى المتوسطة pluripotency لمدة 20 يوما.
لتوسيع iPSC، تشريح يدويا المستعمرات الجنينية مثل الخلايا الجذعية التي تشكلت في طبق إعادة البرمجة باستخدام ماصة زجاجية سحبت. نشر iPSCs بشكل مناسب، والتدليك كل خمسة إلى سبعة أيام. كانت iPCSs إيجابية لفوسفاتاز علامة متعددة العلامات القلوية.
توليد الأجسام الجنينية عن طريق قطع مستعمرات iPSC إلى قطع صغيرة والطلاء لهم في انخفاض مرفق أطباق بيتري في المتوسط الجسم الجنينية. يتم تحريض التمايز Ectoderm عن طريق طلاء اليوم أربعة أجسام جنينية في وسط التمايز ectoderm. وبالمثل ، يتم تحريض التمايز mesoderm عن طريق طلاء اليوم الثامن الهيئات الجنينية في المتوسط التمايز mesoderm.
لتحفيز التمايز endoderm، ثقافة iPSCs في طبقة واحدة في وسط التمايز endoderm. ورصدت التغيرات الشكلية في الخلايا الليفية على مدى إعادة البرمجة. أنها تعبر عن مورفولوجيا تشبه الخلايا الظهارية وشكلت المستعمرات المدمجة.
كان للخلايا أيضا نواة ارتفاع إلى نسبة السيتوبلازمية ، نموذجية من الخلايا متعددة القدرات في الثقافة. تمتلك iPSCs نوع الناقل XO 45 وكانت إيجابية لعلامات متعددة المؤشرات OCT4، NANOG، SOX 2، SSEA 4، TRA-1-81 وE-CADHERIN. كانت الخلايا ملطخة بعلامات طبقة الجرثومية التمثيلية.
وبالتالي تطور متلازمة تيرنر العجز العصبي المعرفي. الخلايا العصبية المستمدة من متلازمة تيرنر iPSC يمكن أن يكون نموذجا ممتازا. هذا هو على غرار في لوحة بتري لفهم الخط الجديد من متلازمة تيرنر التفكك العادي.
