El síndrome de Turner es una afección rara asociada con la falta total o parcial del cromosoma X. El síndrome se caracteriza por infertilidad, baja estatura, trastornos cardiovasculares y defectos neurocognitivos. En algunos casos, causa la muerte fetal.
Aunque las células somáticas de los fetos aneuploides son biológicamente valiosas, son de corta duración, lo que limita su uso en la investigación. La generación de iPSC es, por lo tanto, un método eficaz de preparación celular para la conservación perpetua de los rasgos aneuploides. Se autorrenovan y pueden diferenciarse en tipos de células especializadas que recuerdan el desarrollo embrionario temprano.
La entrega de plásmidos de reprogramación episomal no integradores a través de la ficción nuclear es un método eficiente y reproducible para generar iPSC completamente reprogramados y estables. Este método también se puede utilizar en células que son difíciles de programar. En este protocolo describimos la regeneración de iPSCs a partir de material fetal con anepupliod.
Transfiera las vellosidades coriónicas fetales recolectadas a una placa de Petri estéril. Lávelo varias veces con PBS que contenga 1X solución antimicótica antibiótica. Retire el PBS por completo mediante pipeteo.
Agregue 1 ml de mezcla de colagenasa a las vellosidades e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos o hasta que el tejido se desintegre. Después de la incubación, neutralice la colagenasa agregando medios que contengan 10% de suero bovino fetal. Transfiera el contenido de la placa de Petri a un tubo de 15 ml.
Centrifugar el digesto para recoger las vellosidades desintegradas y las células liberadas. Decanta el sobrenadante con cuidado. Placa de vellosidades desintegradas junto con células liberadas en un matraz de cultivo T25 y medios AmnioMAX y crecen hasta obtener un cultivo de fibroblastos confluentes.
Ampliar los fibroblastos y el cultivo para preparar las existencias para su uso en experimentos posteriores de transfección y caracterización. Preparar cultivos de álcali que contengan los plásmidos reprogramadores. Aísle los plásmidos utilizando el kit de purificación de plásmidos Midi, según las instrucciones del fabricante.
Vuelva a suspender cada palet en un volumen adecuado de agua libre de DNAse RNAse para obtener una concentración final de 1 microgramo por mililitro. Verifique los plásmidos utilizando el kit de digestión de restricción ECoR1, siguiendo las instrucciones del fabricante. Tripsinizar los fibroblastos de vellosidades coriónicas.
Neutralizar y centrifugar para recoger las células. Decantar el sobrenadante, y volver a suspender las células en 5 ml OPTI-MEM. Cuente las células usando un hemocitómetro y extraiga 1 millón de células para la nucleofección.
Centrífuga para obtener palet celular. Realizar nucleofection utilizando Amaxa NHDF Neucleofactor Kit. Prepare el reactivo neucleofactor mezclando el suplemento de 0,5 ml y la solución de nucleofactor de 2,25 ml proporcionada en el kit.
Retire 100 microlitros de solución de nucleofactor y agréguele 1 microgramo de cada plásmido. Vuelva a suspender suavemente 1 millón de células en esta mezcla. Transfiera la suspensión de ADN celular a la cubeta, asegurándose de que la muestra cubra la parte inferior de la cubeta sin burbujas de aire.
Tapa la cubeta e insértelo en el soporte. Seleccione el programa de nucleofactores D-23 para una alta eficiencia y aplíquelo. Retire la cubeta del soporte y agregue 1 ml de soporte AmnioMAX.
Transfiera el contenido suavemente a una placa de Petri tratada con cultivo de tejidos, utilizando la pipeta proporcionada en el kit. Incubar las células en una incubadora de dióxido de carbono humidificado a 37 grados centígrados. Mantenga las células en medios AmnioMAX durante 10 días y luego cambie a medio de pluripotencia durante 20 días.
Para la expansión de iPSC, diseccione manualmente las colonias embrionarias similares a células madre formadas en el plato de reprogramación utilizando una pipeta de vidrio tirado. Propague las iPSC de manera adecuada y masajee cada cinco a siete días. Los iPCS fueron positivos para el marcador de pluripotencia fosfatasa alcalina.
Genere cuerpos embrionarios cortando las colonias de iPSC en trozos pequeños y chapándolas en placas de Petri de baja fijación en medio de cuerpo embrionario. La diferenciación del ectodermo se induce al enchapar el día cuatro cuerpos embrionarios en el medio de diferenciación del ectodermo. Del mismo modo, la diferenciación del mesodermo es inducida por el recubrimiento del día ocho cuerpos embrionarios en el medio de diferenciación del mesodermo.
Para inducir la diferenciación del endodermo, culta iPSCs en una monocapa en medio de diferenciación del endodermo. Los cambios morfológicos en los fibroblastos fueron monitoreados en el transcurso de la reprogramación. Expresan morfología epitelial similar a la de las células y formaron colonias compactas.
Las células también tenían una relación de núcleo a citoplasma de altura, típica de las células pluripotentes en cultivo. Los iPSC poseían un tipo portador de 45 XO y fueron positivos para los marcadores de pluripotencia OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 y E-CADHERIN. Las células se tiñeron para marcadores representativos de la capa germinal.
El síndrome de Turner desarrolla así déficits neurocognitivos. Las neuronas derivadas del síndrome de Turner iPSC pueden ser un excelente modelo. Esto se modela en una placa de Petri para comprender la nueva línea del síndrome de Turner disociativo normal.
