תסמונת טרנר היא מצב נדיר הקשורים לכרומוזום X חסר לחלוטין או חלקית. התסמונת מאופיינת באי פוריות, קומתו הקצרה, הפרעות לב וכלי דם ופגמים נוירו-קוגניטיביים. במקרים מסוימים, זה גורם למוות עוברי.
למרות תאים סומטיים של עוברים aneuploid הם בעלי ערך ביולוגי, הם קצרי מועד, ובכך להגביל את השימוש בהם במחקר. דור של iPSC הוא אפוא שיטה יעילה של הכנת תאים לשימור תמידי של התכונות aneuploid. הם מתחדשים בעצמם ויכולים להבדיל לסוגי תאים מיוחדים המזכירים התפתחות עוברית מוקדמת.
אספקה של פלסמידים אפיזומליים שאינם משתלבים באמצעות בדיה גרעינית היא שיטה יעילה ווניתנת לשחזור ליצירת iPSC מתוכנתים מחדש ויציבים לחלוטין. שיטה זו יכולה לשמש גם בתאים שקשה לתכנת. בפרוטוקול זה אנו מתארים התחדשות של IPSCs מחומר עוברי עם aneupliod.
מעבירים את הווילי הכוריוני העוברי שנאסף לצלחת פטרי סטרילית. לשטוף אותו מספר פעמים עם PBS המכיל 1X פתרון אנטימיקוטי אנטיביוטי. הסר את PBS לחלוטין על ידי pipetting.
מוסיפים תערובת קולגנאז 1 מ"ל לוילי ודגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או עד שהרקמה מתפוררת. לאחר הדגירה, לנטרל את collagenase על ידי הוספת מדיה המכילה 10% סרום בקר עוברי. מעבירים את תכולת צלחת הפטרי לצינור של 15 מ"ל.
צנטריפוגות התקציר כדי לאסוף את villi מפורק ותאים משוחררים. דק את supernatant בזהירות. צלחת התפרק villi יחד עם תאים משוחררים בבקבוקן תרבות T25 ומדיה AmnioMAX ולגדול עד תרבות פיברובלסט confluent מתקבלת.
להרחיב פיברובלסטים ותרבות כדי להכין מניות לשימוש בניסויי טרנס-זיהום ואפיון הבאים. הכן תרבויות של אלקלי המכילות את הפלסמידים המתכנתים מחדש. לבודד את plasmids באמצעות ערכת טיהור Midi plasmid, בהתאם להוראות היצרן.
להשעות מחדש כל משטח בנפח מתאים של DNAse RNAse מים חינם כדי לקבל ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם למיליליטר. אמת את הפלסמידים באמצעות ערכת העיכול להגבלת ECoR1, בהתאם להוראות היצרן. נסה את הפיברובלסטים הוויריוניים.
לנטרל, וצנטריפוגה כדי לאסוף את התאים. פירוק supernatant, ולהשעות מחדש את התאים ב 5 מ"ל OPTI-MEM. לספור את התאים באמצעות hemocytometer, ולהסיר 1 מיליון תאים עבור nucleofection.
צנטריפוגה להשגת משטח תא. בצע נוקלאופקטציה באמצעות ערכת נוקליאופוקטור Amaxa NHDF. הכן ריאגנט נוקליאופוקטור על ידי ערבוב תוספת 0.5 מ"ל ופתרון נוקלאופקטור 2.25 מ"ל המסופק בערכה.
הסר 100 microliters של פתרון נוקלאופקטור, ולהוסיף 1 מיקרוגרם של כל plasmid אליו. בעדינות להשעות מחדש 1 מיליון תאים בתערובת זו. העבר את השעיית DNA התא לתוך cuvette, להבטיח כי המדגם מכסה את החלק התחתון של cuvette ללא כל בועות אוויר.
מכסים את הקובט ומכניסים למחזיק. בחר את תוכנית הנוקלאופקטור D-23 ליעילות גבוהה, והייש ליישם. הסר cuvette מהמחזיק, ולהוסיף 1 מ"ל של מדיית AmnioMAX.
מעבירים את התוכן בעדינות לצלחת פטרי שטופלת בתרבית הרקמות, באמצעות הפיפטה המסופקת בערכה. לדגור על התאים באינקובטור פחמן דו חמצני לח ב 37 מעלות צלזיוס. שמור על התאים במדיה AmnioMAX במשך 10 ימים ולאחר מכן לעבור למדיום pluripotency במשך 20 ימים.
להרחבת IPSC, ניתחו ידנית את המושבות העובריות דמויות תאי גזע שנוצרו בצלחת התכנות מחדש באמצעות פיפטה מזכוכית משוך. יש להפיץ IPSCs כראוי, ולעסות כל חמישה עד שבעה ימים. iPCSs היו חיוביים עבור סמן pluripotency אלקליין פוספטאז.
ליצור גופים עובריים על ידי חיתוך מושבות iPSC לחתיכות קטנות ציפוי אותם בצלחות פטרי מצורף נמוך במדיום הגוף העוברי. בידול Ectoderm מושרה על ידי ציפוי יום ארבעה גופים עובריים במדיום בידול ectoderm. באופן דומה, בידול mesoderm מושרה על ידי ציפוי יום שמונה גופים עובריים במדיום בידול mesoderm.
לגרימת בידול אנדודרם, iPSCs תרבות ב monolayer במדיום בידול אנדודרם. שינויים מורפולוגיים בפיברובלסטים היו במעקב במהלך התכנות מחדש. הם מבטאים מורפולוגיה דמוית תא אפיתל ויוצרים מושבות קומפקטיות.
לתאים היה גם גרעין גובה ליחס ציטופלסמי, אופייני לתאים פלוריפוטנטים בתרבית. ל- iPSCs היה סוג נושאת XO 45 והם היו חיוביים עבור סמני פלוריפונטיות OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 ו- E-CADHERIN. התאים היו מוכתמים בסמנים מייצגים של שכבת נבט.
תסמונת טרנר ובכך מפתחת ליקויים נוירו-קוגניטיביים. נוירונים הנגזרים תסמונת טרנר iPSC יכול להיות מודל מצוין. זה מעוצב בצלחת פטרי כדי להבין את הקו החדש של תסמונת טרנר מנותק נורמלי.
