La sindrome di Turner è una condizione rara associata a un cromosoma X completamente o parzialmente mancante. La sindrome è caratterizzata da infertilità, bassa statura, disturbi cardiovascolari e difetti neurocognitivi. In alcuni casi, provoca la morte fetale.
Sebbene le cellule somatiche dei feti aneuploidi siano biologicamente preziose, sono di breve durata, limitando così il loro uso nella ricerca. La generazione di iPSC è quindi un metodo efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua dei tratti aneuploidi. Sono auto-rinnovanti e possono differenziarsi in tipi di cellule specializzate che ricordano lo sviluppo embrionale precoce.
La somministrazione di plasmidi di riprogrammazione episomiale non integrante attraverso la finzione nucleare è un metodo efficiente e riproducibile per generare iPSC completamente riprogrammati e stabili. Questo metodo può essere utilizzato anche su celle difficili da programmare. In questo protocollo descriviamo la rigenerazione di iPSC da materiale fetale con aneupliod.
Trasferire i villi corionici fetali raccolti in una capsula di Petri sterile. Lavarlo più volte con PBS contenente 1X soluzione antibiotica antimicotica. Rimuovere completamente il PBS mediante pipettaggio.
Aggiungere 1 ml di miscela di collagenasi ai villi e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti o fino a quando il tessuto si disintegra. Dopo l'incubazione, neutralizzare la collagenasi aggiungendo mezzi contenenti il 10% di siero bovino fetale. Trasferire il contenuto della capsula di Petri in un tubo da 15 ml.
Centrifugare il digest per raccogliere i villi disintegrati e le cellule rilasciate. Decantare attentamente il surnatante. Villi disintegrati a piastra insieme a cellule rilasciate in un pallone di coltura T25 e mezzi AmnioMAX e crescono fino a ottenere una coltura di fibroblasti confluenti.
Espandere i fibroblasti e la coltura per preparare le scorte per l'uso in successivi esperimenti di trasfezione e caratterizzazione. Preparare colture di alcali contenenti i plasmidi riprogrammanti. Isolare i plasmidi utilizzando il kit di purificazione del plasmide Midi, secondo le istruzioni del produttore.
Sospendere di ricaspendere ogni pallet in un volume adeguato di acqua libera da DNAse RNAse per ottenere una concentrazione finale di 1 microgrammo per millilitro. Verificare i plasmidi utilizzando il kit di digestione di restrizione ECoR1, seguendo le istruzioni del produttore. Tripsinizzare i fibroblasti dei villi corionici.
Neutralizzare e centrifugare per raccogliere le cellule. Decantare il surnatante e sospendere di sospendere le cellule in 5 ml di OPTI-MEM. Contare le cellule usando un emocitometro e rimuovere 1 milione di cellule per la nucleofezione.
Centrifuga per ottenere pallet di celle. Eseguire la nucleofezione utilizzando Amaxa NHDF Neucleofactor Kit. Preparare il reagente neucleofactor miscelando 0,5 mL di supplemento e 2,25 mL di soluzione nucleofattoriali fornita nel kit.
Rimuovere 100 microlitri di soluzione nucleofattori e aggiungere 1 microgrammo di ciascun plasmide ad esso. Sospendere delicatamente 1 milione di cellule in questo mix. Trasferire la sospensione di DNA cellulare in cuvetta, assicurando che il campione copra il fondo della cuvetta senza bolle d'aria.
Tappare la cuvetta e inserirla nel supporto. Selezionare il programma nucleofattori D-23 per un'elevata efficienza e applicare. Rimuovere la cuvetta dal supporto e aggiungere 1 mL di supporto AmnioMAX.
Trasferire delicatamente il contenuto in una capsula di Petri trattata con coltura tissutale, utilizzando la pipetta fornita nel kit. Incubare le cellule in un incubatore di anidride carbonica umidificato a 37 gradi Celsius. Mantenere le cellule in amnioMAX media per 10 giorni, quindi passare al mezzo di pluripotenza per 20 giorni.
Per l'espansione iPSC, sezionare manualmente le colonie embrionali simili a cellule staminali formate nel piatto di riprogrammazione utilizzando una pipetta di vetro tirata. Propagare le iPSC in modo appropriato e massaggiare ogni cinque-sette giorni. Gli iPCS sono risultati positivi per la fosfatasi alcalina marcatore di pluripotenza.
Generare corpi embrioidi tagliando le colonie di iPSC in piccoli pezzi e placcandole in piastre di Petri a basso attaccamento in mezzo corporeo embrioide. La differenziazione dell'ectoderma è indotta dalla placcatura di corpi embrioidi del quarto giorno nel mezzo di differenziazione dell'ectoderma. Allo stesso modo, la differenziazione del mesoderma è indotta dalla placcatura di corpi embrionali dell'ottavo giorno nel mezzo di differenziazione del mesoderma.
Per indurre la differenziazione dell'endoderma, coltura iPSC in un monostrato nel mezzo di differenziazione dell'endoderma. I cambiamenti morfologici nei fibroblasti sono stati monitorati nel corso della riprogrammazione. Esprimono una morfologia simile a una cellula epiteliale e formano colonie compatte.
Le cellule avevano anche un rapporto nucleo-citoplasmatico di altezza, tipico delle cellule pluripotenti in coltura. Le iPSC possedevano un tipo di portante 45 XO ed erano positive per i marcatori di pluripotenza OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 ed E-CADHERIN. Le cellule sono state colorate per marcatori rappresentativi dello strato germinale.
La sindrome di Turner sviluppa quindi deficit neurocognitivi. I neuroni derivati dalla sindrome di Turner iPSC possono essere un modello eccellente. Questo è modellato in una piastra di Petri per comprendere la nuova linea della normale sindrome dissociativa di Turner.
