Синдром Тернера является редким состоянием, связанным с полностью или частично отсутствующей Х-хромосомой. Синдром характеризуется бесплодием, невысоким ростом, сердечно-сосудистыми нарушениями и нейрокогнитивными дефектами. В некоторых случаях это вызывает гибель плода.
Хотя соматические клетки анеуплоидных плодов биологически ценны, они недолговечны, что ограничивает их использование в исследованиях. Таким образом, генерация iPSC является эффективным методом клеточной подготовки к постоянному сохранению анеуплоидных признаков. Они самообновляются и могут дифференцироваться в специализированные типы клеток, напоминающие раннее эмбриональное развитие.
Доставка неигрирующих эписомальных перепрограммирующих плазмид через ядерную фантастику является эффективным и воспроизводимым методом генерации полностью перепрограммированных и стабильных iPSC. Этот метод также может быть использован на клетках, которые трудно запрограммировать. В этом протоколе мы описываем регенерацию ИПСК из материала плода анеуплиодом.
Переложите собранные ворсинки хориона плода в стерильную чашку Петри. Промыть его несколько раз ПБС, содержащим 1X антимикотический раствор антибиотика. Полностью удалите PBS путем пипетки.
Добавьте 1 мл смеси коллагеназы в ворсинки и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут или до распада ткани. После инкубации нейтрализуют коллагеназу, добавляя среды, содержащие 10% фетальной бытовой сыворотки. Переложите содержимое чашки Петри в пробирку объемом 15 мл.
Центрифугировать переваритель, чтобы собрать распавленные ворсинки и высвобождающиеся клетки. Тщательно декантант надувной. Пластинчатые распавляющиеся ворсинки вместе с высвобождаемыми клетками в колбе культуры Т25 и среде AmnioMAX и растут до получения сливаемой культуры фибробластов.
Расширение фибробластов и культур для подготовки запасов для использования в последующих экспериментах по трансфекции и характеризации. Готовят культуры щелочей, содержащие перепрограммируемые плазмиды. Изолируйте плазмиды с помощью комплекта для очистки плазмид Midi в соответствии с инструкциями производителя.
Повторно суспендировать каждый поддон в подходящем объеме воды без DNAse RNAse для получения конечной концентрации 1 микрограмм на миллилитр. Проверьте плазмиды с помощью комплекта для рестрикции Сбраживания ECoR1, следуя инструкциям производителя. Трипсинизируют фибробласты ворсинок хориона.
Нейтрализуют и центрифугируют для сбора клеток. Декантируют супернатант и повторно суспендируют клетки в 5 мл ОПТИ-МЭМ. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и удалите 1 миллион клеток для нуклеофекции.
Центрифуга для получения ячейки поддона. Выполните нуклеофекцию с помощью набора нейклеофакторов Amaxa NHDF. Готовят нейклеофакторный реагент путем смешивания добавки 0,5 мл и раствора нуклеофактора 2,25 мл, поставляемого в комплекте.
Удалите 100 микролитров раствора нуклеофактора и добавьте в него по 1 микрограмму каждой плазмиды. Осторожно повторно приостановите 1 миллион клеток в этой смеси. Перенесите суспензию клеточной ДНК в кювету, убедившись, что образец покрывает дно кюветы без каких-либо пузырьков воздуха.
Заткнуть кювету крышкой и вставить в держатель. Выберите нуклеофакторную программу Д-23 для высокой эффективности и примените. Извлеките кювету из держателя и добавьте 1 мл носителя AmnioMAX.
Аккуратно перенесите содержимое в культуру тканей, обработанную чашкой Петри, используя пипетку, в комплекте. Инкубируют клетки в увлажненный инкубатор углекислого газа при 37 градусах Цельсия. Поддерживайте клетки в среде AmnioMAX в течение 10 дней, а затем переходите на среду плюрипотентности в течение 20 дней.
Для расширения iPSC вручную рассекают колонии, подобные эмбриональным стволовым клеткам, образованные в чашке для перепрограммирования, используя вытянутую стеклянную пипетку. Размножайте ИПСК соответствующим образом и массируйте каждые пять-семь дней. iPCS были положительными для маркера плюрипотентности щелочной фосфатазы.
Генерировать эмбриоидные тела, разрезая колонии iPSC на мелкие кусочки и покрывая их в чашках Петри с низким прикреплением в эмбриоидной среде тела. Дифференцировка эктодермы индуцируется покрытием эмбриональных тел четвертого дня в среде дифференцировки эктодермы. Аналогичным образом, дифференциация мезодермы индуцируется покрытием восьми дней эмбриоидных тел в среде дифференцировки мезодермы.
Для индуцирования дифференцировки эндодермы культивируют иПСК в монослой в среде дифференцировки эндодермы. Морфологические изменения фибробластов контролировались в ходе перепрограммирования. Они экспрессируют эпителиальную клеточную морфологию и образуют компактные колонии.
Клетки также имели соотношение высоты ядра к цитоплазматическому, типичное для плюрипотентных клеток в культуре. ИПСК обладали типом носителя XO 45 и были положительными для маркеров плюрипотентности OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 и E-CADHERIN. Клетки окрашивали для репрезентативных маркеров зародышевого слоя.
Таким образом, синдром Тернера развивает нейрокогнитивный дефицит. Нейроны, полученные из синдрома Тернера iPSC, могут быть отличной моделью. Это смоделировано в пластине Петри, чтобы понять новую линию нормального диссоциативного синдрома Тернера.
