Turner sendromu, tamamen veya kısmen eksik olan X kromozomu ile ilişkili nadir bir durumdur. Sendrom kısırlık, kısa boy, kardiyovasküler bozukluklar ve nöroknaknitif kusurlar ile karakterizedir. Bazı durumlarda fetal ölüme neden olur.
Aneuploid fetüslerin somatik hücreleri biyolojik olarak değerli olmasına rağmen, kısa ömürlüdir, böylece araştırmada kullanımlarını sınırlarlar. Bu nedenle iPSC üretimi, aneuploid özelliklerinin sürekli korunması için etkili bir hücre hazırlama yöntemidir. Kendi kendini yenilerler ve erken embriyonik gelişimi anımsatan özel hücre tiplerine farklılaşabilirler.
Entegre olmayan epizomal reprogramlama plazmidlerinin nükleer kurgu yoluyla teslim edilmesi, tamamen yeniden programlanmış ve kararlı iPSC'ler üretmek için verimli ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu yöntem, programlanın zor olan hücrelerde de kullanılabilir. Bu protokolde iPSC'lerin fetal materyalden aneupliod ile yenilenmesini açıklıyoruz.
Toplanan fetal koryonik villiyi steril bir Petri kabına aktarın. 1X antibiyotik antimycotic çözeltisi içeren PBS ile birkaç kez yıkayın. PBS'yi pipetleme ile tamamen çıkarın.
Villiye 1 ml kollajenaz karışımı ekleyin ve 10 dakika boyunca veya doku parçalanana kadar 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. İnkübasyondan sonra% 10 fetal Sığır Serumu içeren ortam ekleyerek kollajenazı nötralize edin. Petri kabının içeriğini 15 ml'lik bir tüpe aktarın.
Parçalanmış villi ve serbest bırakılan hücreleri toplamak için sindirimi santrifüjlayın. Üst saltantı dikkatlice deklare edin. Plaka, T25 kültür şişesi ve AmnioMAX ortamlarında salınan hücrelerle birlikte villi parçalandı ve bir araya gelen fibroblast kültürü elde edilene kadar büyüdü.
Stokları sonraki transfeksiyon ve karakterizasyon deneylerinde kullanıma hazırlamak için fibroblastları ve kültürü genişletin. Yeniden programlanan plazmidleri içeren alkali kültürlerini hazırlayın. Plazmidleri, üreticinin talimatlarına göre Midi plazmid arıtma kiti kullanarak izole edin.
Mililitre başına 1 mikrogramlık son konsantrasyon elde etmek için her paleti uygun miktarda DNASE RNAse içermeyen suda yeniden askıya alın. Üreticinin talimatlarına uyarak ECoR1 kısıtlama sindirim kitini kullanarak plazmidleri doğrulayın. Koryonik villi fibroblastları deneyin.
Hücreleri toplamak için nötralize edin ve santrifüjlayın. Süpernatantı dekante edin ve hücreleri 5 ml OPTI-MEM'de yeniden askıya alın. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve nükleofeksiyon için 1 milyon hücreyi çıkarın.
Hücre paleti elde etmek için santrifüj. Amaxa NHDF Neucleofactor Kit kullanarak nükleofeksiyon gerçekleştirin. Kitte verilen 0,5 mL takviyesi ve 2,25 mL nükleofaktör çözeltisini karıştırarak neükleofactor reaktifi hazırlayın.
100 mikrolitre nükleofaktör çözeltisini çıkarın ve her plazmidden 1 mikrogram ekleyin. Bu karışımdaki 1 milyon hücreyi yavaşça yeniden askıya alın. Hücre DNA süspansiyonunu cuvette'e aktarın, numunenin herhangi bir hava kabarcığı olmadan cuvette'in altını kaplamasını sağlayın.
Cuvette'i kapla ve tutucuya tak. Yüksek verimlilik için D-23 nükleofactor programını seçin ve uygulayın. Cuvette'i tutucudan çıkarın ve 1 mL AmnioMAX ortam ekleyin.
İçeriği, kitte verilen pipeti kullanarak, petri kabını tedavi edilen bir doku kültürüne hafifçe aktarın. Hücreleri 37 santigrat derecede nemlendirilmiş karbondioksit inkübatöründe kuluçkaya yatır. AmnioMAX ortamlarındaki hücreleri 10 gün boyunca koruyun ve ardından 20 gün boyunca pluripotency ortamına kaydırın.
iPSC genişlemesi için, çekilen bir cam pipet kullanarak yeniden programlama kabında oluşan embriyonik kök hücre benzeri kolonileri manuel olarak parçalara ayırın. IPSC'leri uygun şekilde yayın ve her beş ila yedi günde bir masaj yapın. iPCS'ler pluripotency marker alkalin fosfataz için pozitifti.
iPSC kolonilerini küçük parçalara ayırarak ve embriyoid vücut ortamında düşük ekli Petri kaplarına kaplayarak embriyoid cisimler oluşturun. Ektoderm farklılaşması, dördüncü gün embriyoid cisimlerinin ektoderm farklılaşma ortamında kaplanması ile indüklenmiştir. Benzer şekilde mezoderm farklılaşması, mezoderm farklılaşma ortamında sekizinci gün embriyoid cisimlerinin kaplanması ile indüklenmektedir.
Endoderm farklılaşmasına neden olmak için, endoderm farklılaşma ortamında bir monolayerde kültür iPSC'leri. Fibroblastlardaki morfolojik değişiklikler yeniden programlama sırasında izlendi. Epitel hücre benzeri morfolojiyi ifade ederler ve kompakt koloniler oluştururlar.
Hücreler ayrıca kültürdeki pluripotent hücrelerinin tipik bir boyuna sitoplazmik orana sahip bir yükseklik çekirdeğine sahipti. IPSC'ler 45 XO taşıyıcı tipine sahipti ve PLURIPOTENCY belirteçleri OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 ve E-CADHERIN için pozitifti. Hücreler temsili mikrop tabakası belirteçleri için boyandı.
Turner Sendromu böylece nöroknatif eksiklikler geliştirir. Turner Sendromu iPSC'den elde edilen nöronlar mükemmel bir model olabilir. Bu, normal disassociative Turner Sendromu'nun yeni çizgisini anlamak için bir petri plakasında modellenmiştir.
