用于高内涵筛选和分析应用的大规模生产球体的稳健方法

该协议提供了一种方法，可以在适用于自动显微镜的多孔板的每个孔中产生数百个多细胞肿瘤球体。产生的球体可以分为不同的大小类别，并且可以从每个细胞中提取亚细胞信息。该技术产生足够的血清，可用于直接筛选和RNA干扰研究。

使用保持在零下20摄氏度的预冷尖端将ECM基底材料稀释在冷酚红血清游离培养基中。我打赌15微升的ECM基底材料和培养基溶液进入96孔成像板。将板在4摄氏度下以91倍G离心20分钟。

将板在37摄氏度下孵育不超过30分钟。将行程和 EDTA 添加到单元格中。在孵育结束时将细胞在37摄氏度下孵育，我们将细胞悬浮在含有10%FBS的完整培养基中。

将10微升细胞悬浮液移液，放入血细胞计数器计数室中。计算腔室四个象限中的细胞数量。Centra在室温下以135倍G观察细胞四分钟。

一种是沉淀该细胞，吸出上清液并将细胞重悬于无酚红的完整培养基中，以获得每毫升10至6个细胞的浓度。在不含酚红的完全培养基中稀释细胞。看到细胞以圆周运动以每孔35微升的总体积下降。

将细胞在37摄氏度下在具有5%二氧化碳的加湿培养箱中孵育一小时。每孔1.2微升ECM基底材料至23.8微升无酚红完整培养基，最终体积为每孔60微升。将细胞在37摄氏度下在具有5%二氧化碳的加湿培养箱中孵育。

第二天，用100微升新鲜酚红游离完全培养基替换培养基。将含有球体的96孔板插入共聚焦高内涵筛选显微镜中。选择合适的激光器来激发所使用的地板。

按顺序获取通道以避免串扰，使用适当的物镜对椭球体进行成像。为了分析球体的形态，根据荧光共轭的FLoid和染色对球体进行分割。根据六角三，四，二染色来分割细胞核。

通过细胞质中存在的残留的三，三，四，二，染色剂分割每个细胞的细胞质。计算旋转椭球体的不同形态特性，包括体积、表面积、球形度和每个球体的原子核数量。罗斯有进一步的图像来去除小于75立方米和大于900， 000立方米的球体。

要分析球体中的单个细胞，请根据荧光共轭的球体染色来分割球体。根据六角三，四，二染色来分割细胞核。通过细胞质中存在的残留的六角形三，三，三，四，二染色剂来分割每个细胞的细胞质。

根据二抗染色对溶酶体进行分段。计算每个球体内细胞的不同形态学性质，包括每个细胞的溶酶体数量，细胞体积和细胞表面积。该图很好地显示了三种不同类型的球体的概述，包括不同共聚焦平面上的图像。

还显示了整个旋转椭球体的体积视图。该图显示了pH分割过程，面板A显示了体积视图中的整个球体。图B显示单个球体的所有细胞内的细胞质，细胞核和溶酶体的集合分割。

细胞质和细胞核根据六角三，四，二染色进行分段。溶酶体根据抗实验室一抗体染色进行分段。面板 C 显示的分段与面板 B 相同，但以三个普通视图显示。

可以在椭球体水平上进行各种形态测量。这些测量包括计算每个球体的原子核数量，以及这些费利西度，体积和pH的表面积。三种球体类型中每个细胞的典型体积。

以及每个细胞的溶酶体数量显示在此图中。在 SP 生成开始时优化初始单元座密度是关键步骤。该图显示，添加过多的细胞仍然允许球体形成。

但是，如果球体，这可能导致聚变。以这种方式产生的球状体可以进行转录组学和蛋白质组学分析。该技术用于定量分析药物递送这种纳米颗粒的摄取，并评估它们对球状体中单个细胞的毒性。