我们的协议可用于可视化有机体的结构复杂性，允许以单细胞分辨率在这些 3D 结构中映射身份、硫酸盐和分布。我们的快速三天协议针对各种来源的有机体进行了全面优化，并使用简单的样品制备，包括无毒光学清除步骤和硅基安装方法。尽管我们的协议非常简单，但其中一些是关键步骤，如有组织的处理或幻灯片准备，可以通过可视化演示比通过文本进行更好的解释。
要回收24个井板中生长在地下膜提取物中生长的100至500微米的有机体，用PBS清洗每个焊缝，而不破坏3D基质，然后将板放在冰上。在每个井中加入一毫升的冰冷恢复溶液，并将板在4摄氏度的水平摇床上放置30至60分钟。将一毫升移液器尖端浸入 PBS 溶液中的 1% BSA 中，上下两次移液器，用 BSA 覆盖每个尖端。
接下来，将五毫升 1%PBS BSA 添加到每个条件中的 15 毫升管中，并在丢弃溶液之前将管反转两到三次，以覆盖管内。要收集器官，请使用涂层尖端轻轻重新悬浮井内 5 至 10 次，并在单个涂层 15 毫升管中从每种条件下拉出所有器官。用一毫升的冰冷 1%PBS BSA 冲洗每口井，以确保所有器官都收集好了，然后将洗涤液转移到适当的管中。
将每个管中的最终体积与冷 PBS 一起带到 10 毫升，通过离心沉淀器官，以获得一个没有可见层 3D 矩阵的紧密调色板。要修复器官，请使用涂有一毫升移液器尖端，小心地将每个颗粒重新悬浮在一毫升冰冷的甲醛中，并在4摄氏度下固定45分钟。在固定时间进行到一半时轻轻重新悬挂器官。
45分钟后，将10毫升的冰冷PBS加补间20加入每个管，然后通过反转轻轻混合，然后将管子在4摄氏度下放置10分钟。为了阻断器官，在孵化结束时，将样品旋转下来，并在每井要镀的至少200微升的冰冷有机体洗涤缓冲液中重新悬浮颗粒。然后将器官转移到24孔悬浮板的单个孔中，在4摄氏度下孵育15分钟。
用于免疫标记的有机体洗涤缓冲液加入200微升的空参考井，使器官沉淀到板的底部。当器官稳定下来后，以 45 度角倾斜板，以便去除除最后 200 微升洗涤缓冲液外的所有。接下来，加入200微升含有原抗体的有机体洗涤缓冲液，将板在4摄氏度下过夜，每分钟40圈轻微摇晃。
第二天早上，在每一个井里加入一毫升的有机洗涤缓冲液，让有机体在盘子底部沉淀三分钟。当器官稳定下来后，从每井中取出除最后200微升外的所有微升，用三个两小时洗涤，用一毫升新鲜有机体洗涤缓冲液清洗器官，每次洗涤时有轻微的摇晃和摇晃。第三次洗涤后，让有机体在盘子底部沉淀三分钟，然后从每井中取出除最后200微升的有机体洗涤缓冲液。
在每个井中加入200微升的有机洗涤缓冲液，含有适当的二次抗体，在4摄氏度下进行夜间孵育，并轻微摇晃和摇晃。第二天早上，用三个两小时的洗涤在一毫升的新鲜有机体洗缓冲液每次洗涤，如证明。最后一次洗涤后，将器官转移到每井1.5毫升管中，通过离心收集器官。
对于器官的光学清除，从每个管中去除尽可能多的洗涤缓冲液，而不破坏器官，并使用经过修改的200微升移液器尖端在每个颗粒中添加至少50微升的FUNGI。在室温下孵育20分钟后，器官可以在4摄氏度下储存长达一周，或在零下20摄氏度下储存长达6个月。要通过共体显微镜为器官成像准备幻灯片，请用硅胶密封剂填充 10 毫升注射器，并在注射器上安装经过修改的 200 微升移液器尖端。
使用注射器在幻灯片中间绘制一个一比两厘米的矩形，并使用第二个经过修改的 200 微升移液器尖端将清除的器官放入矩形的中间。要将盖滑在风琴上，请先将盖板的左侧滑下，然后缓慢地将盖滑器从左至右降低，直到没有被困空气。然后轻轻地对盖滑的所有边缘施加压力，将其牢固地固定在硅胶密封剂上。
要对器官进行成像，请将幻灯片放在共声激光扫描显微镜的舞台上，并选择多浸入式 25 X 目标进行共声成像。将显微镜设置为适当的采集设置，选择低激光功率以减少照片漂白。使用 Z 堆栈模式定义下端上限，并将 Z 步进大小设置为最佳。
当成像大型器官结构或多个器官一起，使用10%重叠的平铺模式，并指示感兴趣的区域。设置所有参数后，在成像软件中获取图像的 3D 渲染表示，并优化亮度、对比度和 3D 渲染属性。然后将结果的 RGB 快照导出为 TIFF 文件。
与 2D 成像相比，3D 成像的强度通过这些小鼠乳腺器官的图像得到说明，这些图像已如图所示生成。这些代表性器官的中心层由柱形K8/K18正发光细胞组成，外层包含拉长的K5正罗勒细胞，概括了体内乳腺的形态。这种极化组织很难从同一器官的二D光学部分来欣赏。
没有3D信息无法解释的复杂结构的另一个例子是 MRP2 正管汁网络，它有助于收集人类肝脏器官的胆汁液。此外，获得的质量和分辨率允许半自动分段和图像分析。因此，在全器官的特定细胞亚型中，可以量化细胞总数和标记的存在。
通过分割包含140个细胞的整个器官的核，可以识别三个显示Ki67细胞周期标记高正性的细胞。光学清除剂FUnGI在细胞深处的荧光信号质量中优于未清除和果糖甘油清除。与清除的器官相比，FUNGI清除的器官显示出整体增强的荧光强度。
请注意，样品中任何残留的 BME 都可能导致抗体渗透率降低，并可能导致高背景信号。此外，囊性有机体在崩溃时不应进行光学清除。通过稍作调整，样品可用于超分辨率共和、多光子和光片显微镜。
