原位 使用透射电子显微镜探索小鼠巨核细胞生成

该程序的总体目标是观察位于小鼠骨髓内的巨核细胞的超结构，并使用高分辨率透射电子显微镜量化不同的成熟阶段。主要优点是在天然环境中直接检查巨核细胞，这与体外培养的巨核细胞不同，我们知道巨核细胞没有达到完全成熟水平。根据标准方案从12至18周龄的C57BL / 6小鼠收获胫骨和股骨后，使用锋利的剃须刀片去除每块骨头上的骨骺。

用镊子固定每块骨头，将21号针头连接到装满二甲丁酸盐缓冲液的5毫升注射器插入骨头的一端，并将骨髓冲洗到含有两毫升新鲜卡可啶酯缓冲液的15毫升收集管中。冲洗后立即使用塑料移液管将骨髓圆柱体转移到一毫升新鲜的戊二醛固定溶液中，在室温下孵育60分钟。为了将骨髓嵌入琼脂糖中，在新鲜的卡地啶盐缓冲液中洗涤固定样品，并使用塑料移液管小心地将骨髓转移到载玻片上。

使用温热的移液器，快速将一滴2%的液体琼脂滴在骨髓圆柱体上，并立即将载玻片放在冰上一到两分钟。当琼脂凝固时，使用体视显微镜和锋利的剃须刀片丢弃每个骨髓圆柱体的四肢，并将修剪过的骨髓块转移到含有一毫升二甲丁酸盐缓冲液的1.5毫升微量离心管中。对于树脂包埋，用1%四氧化锇将块固定在化学罩中的二甲钒酸盐缓冲液中，在4摄氏度下放置一小时，然后用肼二酸缓冲液洗涤块一次，用蒸馏水清洗一次。

水洗后，在蒸馏水中用4%乙酸铀酰染色块一小时，然后在蒸馏水中洗涤两次，如图所示。在最后一次洗涤后，通过一系列上升的乙醇浸泡和蒸馏水对块进行脱水。为了获得骨髓内环氧树脂的均匀浸润和聚合，将块体在两个连续的环氧丙烷浴中孵育15分钟，然后将样品在室温下在100%环氧丙烷和环氧树脂的一对一混合物中孵育一小时。

在孵育结束时，向骨髓块中加入100%环氧树脂，在相同条件下孵育过夜，然后加入100%环氧树脂进行另一次孵育两小时。在孵育结束时，使用显微镜将骨髓块定向到扁平硅胶模具中，以允许其随后的横向切片，并在将其置于60摄氏度下48小时之前用环氧树脂填充模具。对于超薄切片，将样品块安装到超切片机支架上，然后将支架安装到样品架上。

使用金刚石铣刀以45度角修剪样品，以除去组织周围的多余树脂，然后使用装有水箱的金刚石刀刀片分别切割500和100纳米厚的横向切片以进行组织学和TEM分析，然后使用环将漂浮在水面上的500纳米厚切片转移到载玻片上，并将100纳米厚的切片沉积在载玻片上截面到200目薄条铜格栅上，下面有一个纸过滤器。对于甲苯胺蓝染色，在60度热板上绘制500纳米厚的切片后，将蒸馏水中过滤的1%甲苯胺蓝加入切片中，进行一到两分钟的孵育。在孵育结束时，用蒸馏水洗涤样品。

当载玻片干燥后，使用安装介质用盖玻片安装样品，并通过光学显微镜观察样品。对于对比染色，用4%醋酸铀酰标记100纳米切片5分钟，然后用蒸馏水洗涤三次5分钟。在最后一次洗涤后，用柠檬酸铅染色切片三分钟，然后在蒸馏水中洗涤三次五分钟，如图所示。

最后一次洗涤后，首先将每个网格的下侧与一张滤纸接触，以便将网格放置在滤纸上以干燥。要通过TEM检查切片，当网格干燥时，选择低放大倍率以评估制剂的一般质量。为了确定每个横截面中每个成熟阶段的巨核细胞数量，请选择更高的放大倍率并仅在完全被组织覆盖的正方形中量化I期，II期或III期巨核细胞的数量。

在这种具有代表性的组织学分析中，可以清楚地观察到巨核细胞的紧凑性微血管连续性以及大小和形状。小鼠巨核细胞分为四个成熟阶段。I期巨核细胞具有大细胞核。

分界膜系统最早可检测阶段的存在也是该阶段的关键标准。在第二阶段，开始形成颗粒，并开始开发分界膜系统。III期巨核细胞是具有发达的分界膜系统，明确定义的细胞质区域和没有细胞器的外围区域以及偏心定位的细胞核的巨型细胞。

巨核细胞成熟的热细胞阶段的特征是裸核。如图所示，巨核细胞经常观察到与内皮细胞接触。有时，巨核细胞形成穿透内皮的短侵袭性突起，或者它们将丙酸盐延伸到正弦腔中。

TEM还允许可视化超结构细节，以及被巨核细胞吞没的造血细胞的存在。骨髓冲洗必须在骨片解剖后立即仔细进行。为了最大限度地提高组织完整性，在脱水前用琼脂凝胶包围骨髓。

按照这一程序，骨髓块可以在不同的放大倍率下成像，或者可用于其他3D电子显微镜分析，例如聚焦离子束扫描电子显微镜。