O objetivo geral deste procedimento é observar a ultra estrutura de megacaiócitos localizados dentro da medula óssea do rato, e quantificar os diferentes estágios de maturação usando microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução. A principal vantagem é o exame direto dos megacaiócitos no ambiente nativo, que difere dos megacariócitos in vitro cultivados que, como sabemos, não atingem o nível completo de maturação. Depois de colher a tíbia e os fêmures de 12 a 18 semanas de idade C57BL/6 camundongos de acordo com os protocolos padrão, use uma lâmina afiada para remover as epífitas de cada osso.
Segurando cada osso com pinças, insira uma agulha de calibre 21 presa a uma seringa de cinco mililitros preenchida com tampão de cacodilato em uma extremidade do osso e coloque a medula óssea em um tubo de coleta de 15 mililitros contendo dois mililitros de tampão de cacodilato fresco. Imediatamente após a descarga, use uma pipeta de plástico para transferir os cilindros de medula óssea em um mililitro de solução fixativa de glutaraldeído fresco para uma incubação de 60 minutos à temperatura ambiente. Para incorporar a medula óssea em agarose, lave as amostras fixas em tampão de cacodilato fresco e use uma pipeta plástica para transferir cuidadosamente a medula óssea para um slide de vidro.
Usando uma pipeta quente, aplique rapidamente uma gota de ágar líquido de 2% nos cilindros de medula óssea e coloque imediatamente o deslizamento no gelo por um a dois minutos. Quando o ágar se solidificar, use um microscópio estéreo e uma lâmina afiada para descartar as extremidades de cada cilindro de medula óssea e transfira os blocos de medula aparados para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro contendo um mililitro de tampão de cacodilato. Para a incorporação de resina, fixar os blocos com 1%de tetroxida de ósmio em tampão de cacodilato em uma capa química por uma hora a quatro graus Celsius antes de lavar os blocos uma vez com tampão de cacodilato e uma vez com água destilada.
Após a lavagem da água, manche os blocos com acetato de 4%uranyl em água destilada por uma hora seguido de duas lavagens em água destilada como demonstrado. Após a última lavagem, desidrate os blocos através de uma série ascendente de imersões de etanol e água destilada como indicado. Para obter uma infiltração uniforme e polimerização da resina epóxi dentro da medula, incubar os blocos em dois banhos sucessivos de óxido de propileno por 15 minutos antes de incubar as amostras em uma mistura de óxido de propileno 100% e resina epóxi por uma hora em um agitador rotativo lento à temperatura ambiente.
Ao final da incubação, adicione resina 100% epóxi aos blocos de medula para uma incubação durante a noite sob as mesmas condições e adicione resina de 100% epóxi para outra incubação de duas horas. No final da incubação, use um microscópio para orientar os blocos de medula em moldes planos de silicone para permitir sua secção transversal subsequente e encher os moldes com resina epóxi antes de colocá-los a 60 graus Celsius por 48 horas. Para seção ultra fina, monte o bloco de amostra em um suporte de ultra microtome e monte o suporte no suporte da amostra.
Use um cortador de fresagem de diamante para cortar as amostras em um ângulo de 45 graus para remover o excesso de resina ao redor do tecido antes de usar uma lâmina de faca de diamante equipada com um tanque de água para cortar seções transversais de 500 e 100 nanômetros de espessura para análise histológica e TEM, respectivamente, use um laço para transferir as seções de 500 nanômetros de espessura flutuando na superfície da água em um toboágua de vidro e para depositar os 100 nanômetros de espessura. seções em 200 grades de cobre de barra fina de malha com um filtro de papel por baixo. Para coloração azul toluidina, depois de desenhar as seções de 500 nanômetros de espessura em uma placa quente de 60 graus, adicione 1% de azul toluidina filtrado em água destilada às seções para uma incubação de um a dois minutos. No final da incubação, lave as amostras com água destilada.
Quando os slides secarem, use o meio de montagem para montar as amostras com um deslizamento de cobertura e visualizar as amostras por microscopia leve. Para coloração de contraste, rotule as seções de 100 nanômetros com acetato de 4% de urânyl por cinco minutos seguido de três lavagens de cinco minutos com água destilada. Após a última lavagem, manche as seções com citrato de chumbo por três minutos, seguidas por três lavagens de cinco minutos em água destilada como demonstrado.
Após a última lavagem, coloque o lado inferior de cada grade em contato com um pedaço de papel filtro primeiro para permitir que as grades sejam colocadas no papel do filtro para secar. Para examinar as seções por TEM, quando as grades secarem, selecione uma baixa ampliação para avaliar a qualidade geral dos preparos. Para determinar o número de megacaiócitos de cada estágio de maturação em cada seção transversal, selecione uma ampliação maior e quantifique o número de megacaiócitos estágio I, II ou III apenas em quadrados totalmente cobertos por tecido.
Nesta análise histológica representativa, a continuidade da microápcula de compactação e tamanho e forma dos megacaiócitos podem ser claramente observados. Os megacaitos murinos são divididos em quatro estágios de maturação. Os megacaiócitos estágio I têm um grande núcleo.
A presença do estágio detectável mais antigo do sistema de membrana de demarcação também é um critério fundamental desta etapa. No estágio II, começa a formação do grânulo e iniciado o desenvolvimento do sistema de membrana de demarcação. Os megacaitos estágio III são células gigantes com sistemas de membrana de demarcação bem desenvolvidos, territórios citoplasmados claramente definidos e zonas periféricas desprovidas de organelas, e núcleos excêntricos localizados.
O estágio pirenocito da maturação do megacaito é caracterizado por um núcleo nu. Como ilustrado, megacariócitos são frequentemente observados em contato com células endoteliais. Na ocasião, os megacaitos formam breves saliências invasivas que penetram no endotélio ou estendem proplatelets para o lúmen sinusoidal.
O TEM também permite a visualização de detalhes ultraestruturais, bem como a presença de células hematopoiéticas que foram engolidas pelos megacaiócitos. A lavagem da medula óssea deve ser realizada com cuidado e imediatamente após a dissecação óssea. Para maximizar a integridade do tecido, a medula é cercada com um gel de ágar antes da desidratação.
Após este procedimento, os blocos de medula óssea podem ser imagens em diferentes ampliações ou podem ser usados para outras análises de microscopia eletrônica 3D, como microscopia eletrônica de feixe de íons focalizado.
