Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Ultrastruktur von Megakaryozyten im Knochenmark der Maus zu beobachten und die verschiedenen Reifestadien mittels hochauflösender Transmissionselektronenmikroskopie zu quantifizieren. Der Hauptvorteil ist die direkte Untersuchung von Megakaryozyten in der nativen Umgebung, die sich von in vitro kultivierten Megakaryozyten unterscheidet, die, wie wir wissen, nicht den vollständigen Reifegrad erreichen. Nachdem Sie die Tibia und die Femuren von 12 bis 18 Wochen alten C57BL / 6-Mäusen gemäß Standardprotokollen geerntet haben, verwenden Sie eine scharfe Rasierklinge, um die Epiphysen von jedem Knochen zu entfernen.
Halten Sie jeden Knochen mit einer Pinzette, führen Sie eine 21-Gauge-Nadel, die an einer mit Cacodylatpuffer gefüllten Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist, in ein Ende des Knochens ein und spülen Sie das Knochenmark in ein 15-Milliliter-Auffangröhrchen mit zwei Millilitern frischem Cacodylatpuffer. Verwenden Sie unmittelbar nach dem Spülen eine Kunststoffpipette, um die Knochenmarkzylinder für eine 60-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in einen Milliliter frischer Glutaraldehyd-Fixierlösung zu überführen. Um das Knochenmark in Agarose einzubetten, waschen Sie die fixierten Proben in frischem Cacodylatpuffer und verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um das Knochenmark vorsichtig auf einen Glasobjektträger zu übertragen.
Tragen Sie mit einer warmen Pipette schnell einen Tropfen 2% flüssiges Agar auf die Knochenmarkzylinder auf und legen Sie den Objektträger sofort für ein bis zwei Minuten auf Eis. Wenn das Agar erstarrt ist, verwenden Sie ein Stereomikroskop und eine scharfe Rasierklinge, um die Extremitäten jedes Knochenmarkzylinders zu verwerfen und die getrimmten Markblöcke in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Cacodylatpuffer zu übertragen. Für die Harzeinbettung fixieren Sie die Blöcke mit 1% Osmiumtetroxid in Cacodylatpuffer in einer chemischen Haube für eine Stunde bei vier Grad Celsius, bevor Sie die Blöcke einmal mit Cacodylatpuffer und einmal mit destilliertem Wasser waschen.
Nach der Wasserwäsche färben Sie die Blöcke mit 4% Uranylacetat in destilliertem Wasser für eine Stunde, gefolgt von zwei Wäschen in destilliertem Wasser, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche dehydrieren Sie die Blöcke durch eine aufsteigende Reihe von Ethanol-Immersionen und destilliertem Wasser wie angegeben. Um eine gleichmäßige Infiltration und Polymerisation des Epoxidharzes im Mark zu erhalten, inkubieren Sie die Blöcke in zwei aufeinanderfolgenden Propylenoxidbädern für 15 Minuten, bevor Sie die Proben in einer Eins-zu-Eins-Mischung aus 100% Propylenoxid und Epoxidharz für eine Stunde auf einem langsamen Rotationsschüttler bei Raumtemperatur inkubieren.
Am Ende der Inkubation fügen Sie 100% Epoxidharz zu den Markblöcken für eine nächtliche Inkubation unter den gleichen Bedingungen hinzu und fügen Sie dann 100% Epoxidharz für eine weitere Inkubation von zwei Stunden hinzu. Am Ende der Inkubation richten Sie die Markblöcke mit einem Mikroskop in flachen Silikonformen aus, um ihren anschließenden Querschnitt zu ermöglichen, und füllen Sie die Formen mit Epoxidharz, bevor Sie sie für 48 Stunden bei 60 Grad Celsius platzieren. Für ultradünne Schnitte montieren Sie den Probenblock auf einer Ultramikrotomstütze und montieren Sie die Halterung auf dem Probenhalter.
Verwenden Sie einen Diamantfräser, um die Proben in einem Winkel von 45 Grad zu trimmen, um das überschüssige Harz um das Gewebe zu entfernen, bevor Sie eine Diamantmesserklinge mit einem Wassertank verwenden, um quer verlaufende 500 bzw. 100 Nanometer dicke Abschnitte für histologische bzw. TEM-Analysen zu schneiden, dann verwenden Sie eine Schleife, um die 500 Nanometer dicken Abschnitte, die auf der Wasseroberfläche schwimmen, auf einen Glasobjektträger zu übertragen und die 100 Nanometer dicken 100 Nanometer dicken Abschnitte abzuscheiden Schnitte auf 200 Mesh dünne Stabkupfergitter mit einem Papierfilter darunter. Für die Toluidinblaufärbung, nachdem Sie die 500 Nanometer dicken Abschnitte auf einer 60-Grad-Heizplatte gezogen haben, fügen Sie gefiltertes 1% Toluidinblau in destilliertem Wasser zu den Abschnitten für eine ein- bis zweiminütige Inkubation hinzu. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben mit destilliertem Wasser.
Wenn die Objektträger getrocknet sind, verwenden Sie ein Montagemedium, um die Proben mit einem Deckglas zu befestigen und die Proben durch Lichtmikroskopie zu betrachten. Für die Kontrastfärbung beschriften Sie die 100-Nanometer-Abschnitte fünf Minuten lang mit 4% Uranylacetat, gefolgt von drei fünfminütigen Waschungen mit destilliertem Wasser. Nach der letzten Wäsche die Abschnitte drei Minuten lang mit Bleicitrat einfärben, gefolgt von drei fünfminütigen Waschungen in destilliertem Wasser, wie gezeigt.
Legen Sie nach dem letzten Waschen die Unterseite jedes Gitters zuerst mit einem Blatt Filterpapier in Kontakt, damit die Gitter zum Trocknen auf das Filterpapier gelegt werden können. Um die Abschnitte nach TEM zu untersuchen, wählen Sie nach dem Trocknen der Gitter eine geringe Vergrößerung, um die allgemeine Qualität der Zubereitungen zu beurteilen. Um die Anzahl der Megakaryozyten aus jedem Stadium der Reifung in jedem Querschnitt zu bestimmen, wählen Sie eine höhere Vergrößerung und quantifizieren Sie die Anzahl der Megakaryozyten der Stufen I, II oder III nur in Quadraten, die vollständig von Gewebe bedeckt sind.
In dieser repräsentativen histologischen Analyse kann die Kompaktheit der Mikrogefäßkontinuität sowie größe und form der Megakaryozyten deutlich beobachtet werden. Murine Megakaryozyten sind in vier Stadien der Reifung unterteilt. Megakaryozyten im Stadium I haben einen großen Kern.
Das Vorhandensein des frühesten nachweisbaren Stadiums des Abgrenzungsmembransystems ist ebenfalls ein Schlüsselkriterium dieses Stadiums. Im Stadium II beginnt die Granulatbildung und die Entwicklung des Demarkationsmembransystems wird eingeleitet. Megakaryozyten im Stadium III sind Riesenzellen mit gut entwickelten Abgrenzungsmembransystemen, klar definierten zytoplasmatischen Territorien und peripheren Zonen ohne Organellen und exzentrisch angeordneten Kernen.
Das Pyrenozytenstadium der Megakaryozytenreifung ist durch einen nackten Kern gekennzeichnet. Wie dargestellt, werden Megakaryozyten häufig in Kontakt mit Endothelzellen beobachtet. Gelegentlich bilden die Megakaryozyten kurze invasive Vorsprünge, die in das Endothel eindringen, oder sie erstrecken sich in das sinusförmige Lumen.
TEM ermöglicht auch die Visualisierung ultrastruktureller Details sowie das Vorhandensein hämatopoetischer Zellen, die von den Megakaryozyten verschlungen wurden. Die Knochenmarkspülung muss sorgfältig und unmittelbar nach der Knochendissektion durchgeführt werden. Um die Integrität des Gewebes zu maximieren, wird das Mark vor der Austrocknung mit einem Agargel umgeben.
Nach diesem Verfahren können die Knochenmarkblöcke mit unterschiedlichen Vergrößerungen abgebildet oder für andere 3D-elektronenmikroskopische Analysen, wie z.B. die fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie, verwendet werden.
