이 절차의 전반적인 목표는 마우스 골수 내에 위치한 메가카요세포의 초구조를 관찰하고 고해상도 전송 전자 현미경을 사용하여 다른 성숙 단계를 정량화하는 것이다. 주요 장점은 우리가 알고있는 성숙의 전체 수준에 도달하지 않는 체외 배양 메가 카요 세포와 다른 네이티브 환경에서 메가 카요 사이클의 직접 검사입니다. 표준 프로토콜에 따라 12에서 18주 된 C57BL/6 마우스에서 경골과 대퇴골을 수확한 후 날카로운 면도날을 사용하여 각 뼈에서 표피를 제거합니다.
각 뼈에 핀셋을 들고, 골의 한쪽 끝에 코딜레이트 버퍼로 채워진 5밀리리터 주사기에 부착된 21 게이지 바늘을 삽입하고 골수를 신선한 카코디레이트 버퍼 2밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 수집 튜브로 플러시합니다. 플러싱 직후 플라스틱 파이펫을 사용하여 골수 실린더를 실온에서 60분 동안 신선한 글루타랄데히드 고정 용액 1밀리리터로 옮기습니다. 아가로즈에 골수를 담근 경우 고정 샘플을 신선한 캐코디레이트 버퍼에 넣고 플라스틱 파이펫을 사용하여 골수를 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮겨보십시오.
따뜻한 파이펫을 사용하여 골수 실린더에 2%의 액체 화루한 방울을 빠르게 바르고 즉시 슬라이드를 얼음 위에 1~2분 간 놓습니다. 한천이 고화되면 스테레오 현미경과 날카로운 면도날을 사용하여 각 골수 실린더의 사지를 버리고 손질된 골수 블록을 1밀리리터 미세센트심류 튜브로 이송하여 1밀리리터의 카코디레이트 버퍼를 함유합니다. 수지 포함의 경우, 코칼레이트 버퍼로 블록을 한 번 세척하고 증류수로 한 번 세척하기 전에 화학 후드의 1 %osmium 테트산화물을 화학 후드의 4 시간 동안 1 시간 동안 수정하십시오.
물을 씻은 후, 1 시간 동안 증류수에 4 %의 uranyl 아세테이트로 블록을 얼룩지게한 다음 증류수에 두 개의 세척이 시연되었습니다. 마지막 세척 후, 표시된 대로 에탄올 몰입및 증류수의 상승 시리즈를 통해 블록을 탈수. 골수 내부의 에폭시 수지의 균일한 침투 및 중합을 얻으려면, 15 분 동안 프로필렌 옥사이드의 두 개의 연속 목욕에서 블록을 배양한 후 실내 온도에서 느린 회전 셰이커에서 1 시간 동안 100 % 프로필렌 산화물과 에폭시 수지의 1 대 1 혼합물로 샘플을 배양하십시오.
인큐베이션의 끝에서, 같은 조건에서 하룻밤 배양을 위해 골수 블록에 100 %에폭시 수지추가 다음 2 시간의 다른 잠복에 대한 100 %에폭시 수지추가. 인큐베이션의 끝에서, 현미경을 사용하여 평평한 실리콘 금형의 골수 블록을 방향을 지정하여 후속 횡방향 단면을 허용하고 48 시간 동안 섭씨 60도에 놓기 전에 에폭시 수지로 금형을 채웁니다. 초박형 단면의 경우 샘플 블록을 초미세절 지지체에 장착하고 지지대를 샘플 홀더에 장착합니다.
다이아몬드 밀링 커터를 사용하여 45도 각도로 샘플을 다듬어 조직 주위의 과잉 수지를 제거하기 위해 물 탱크가 장착된 다이아몬드 나이프 블레이드를 사용하여 조직 및 TEM 분석을 위해 500 나노미터 두께의 단면을 각각 절단한 다음 루프를 사용하여 500 나노미터 두께의 단면을 이용하여 나노계의 두꺼운 표면을 밀어 내고 10나노미터의 두꺼운 유리를 밀어 내고 나노계를 밀어 냅니다. 아래에 종이 필터가있는 200 메쉬 얇은 막대 구리 그리드에 섹션. toluidine 블루 스테인링의 경우, 60도 핫 플레이트에 500 나노미터 두께의 섹션을 그린 후, 1~2분 간 배양하기 위해 증류수에 여과된 1%의 토루이딘 블루를 섹션에 추가합니다. 인큐베이션이 끝나면 증류수로 샘플을 씻으실 수 있습니다.
슬라이드가 건조되면 마운팅 매체를 사용하여 덮개 슬립으로 샘플을 장착하고 가벼운 현미경으로 샘플을 볼 수 있습니다. 대비 염색의 경우 100 나노미터 섹션을 4%의 우라일 아세테이트로 5분간, 증류수로 5분간 세워세이드합니다. 마지막 세척 후, 3 분 동안 리드 구연산으로 섹션을 얼룩, 시연 된 대로 증류수에 세 5 분 세척.
마지막 세척 후 각 그리드의 하면을 먼저 필터 용지와 접촉하여 그리드를 필터 용지에 배치하여 건조시합니다. TEM에 의해 단면을 검사하려면 그리드가 건조되었을 때 낮은 배율을 선택하여 준비의 일반적인 품질을 평가합니다. 각 횡방향 섹션에서 각 성숙 단계에서 메가카요세포의 수를 결정하려면, 더 높은 배율을 선택하고 완전히 조직에 의해 덮여 사각형에서만 단계 I, II 또는 III 메가카요세포의 수를 정량화한다.
이러한 대표적인 조직학적 분석에서, 메가카요세포의 소형 선도성 및 크기 및 형상을 명확하게 관찰할 수 있다. 뮤린 메가카요세포는 성숙의 4단계로 나뉩니다. 단계 I 메가카요세포에는 큰 핵이 있습니다.
경계 막 시스템의 초기 검출 단계의 존재는 또한이 단계의 주요 기준이다. 단계 II에서, 과립 형성이 시작되고 경계 막 시스템의 개발이 시작된다. 단계 III 거대 카르요세포는 잘 발달된 경계 막 시스템, 세포질 영토 및 세포기관이 없는 주변 구역및 편심으로 위치한 핵을 가진 거대한 세포입니다.
메가카요세포 성숙의 피레노세포 단계는 알몸 핵이 특징입니다. 도시된 바와 같이, 거대 카르요세포는 내피 세포와 접촉하여 자주 관찰된다. 경우에 따라, 메가 카요세포는 내피를 관통하거나 부비동 루멘으로 프로플라츠를 확장하는 짧은 침략적인 돌출부를 형성합니다.
TEM은 또한 초구조적 세부 사항의 시각화뿐만 아니라 거대 카르요세포에 의해 침몰한 조혈 세포의 존재를 허용합니다. 골수 플러싱은 골수 세척 후 신중하고 즉시 수행해야 합니다. 조직의 무결성을 최대화하기 위해, 골수는 탈수 하기 전에 한천의 젤로 둘러싸여 있습니다.
이 절차에 따라, 골수 블록은 상이한 배율에서 심화될 수 있거나, 집중된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 검사법과 같은 다른 3D 전자 현미경 분석에 사용될 수 있다.
