Bu prosedürün genel amacı, fare kemik iliği içinde bulunan megakaryositlerin ultra yapısını gözlemlemek ve yüksek çözünürlüklü iletim elektron mikroskopisi kullanarak farklı olgunlaşma aşamalarını ölçmektir. Ana avantaj, bildiğimiz gibi tam olgunlaşma seviyesine ulaşmayan in vitro kültürlü megakaryositlerden farklı olan megakaryositlerin doğal ortamda doğrudan incelenmesidir. Tibia ve uyluk kemiğini standart protokollere göre 12 ila 18 haftalık C57BL/ 6 fareleri hasat ettikten sonra, her kemikteki epifizleri çıkarmak için keskin bir jilet kullanın.
Her kemiği cımbızla tutarak, kemiğin bir ucuna kakodylat tamponu ile doldurulmuş beş mililitrelik bir şırıngaya bağlı 21 kalibrelik bir iğne yerleştirin ve kemik iliğini iki mililitre taze kakadit tamponu içeren 15 mililitrelik bir toplama tüpüne yıkayın. Yıkamadan hemen sonra, kemik iliği silindirlerini oda sıcaklığında 60 dakikalık bir inkübasyon için bir mililitre taze glutaraldehit fiksatif çözeltisine aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Kemik iliğinin agarose'a gömülmesi için, sabit örnekleri taze kakadodylate tamponunda yıkayın ve kemik iliğini dikkatlice cam bir kaydırağa aktarmak için plastik bir pipet kullanın.
Sıcak bir pipet kullanarak, kemik iliği silindirlerine hızlı bir şekilde% 2 sıvı agar damla uygulayın ve kaydırağı hemen bir ila iki dakika boyunca buza yerleştirin. Agar katılaştığında, her kemik iliği silindirinin ekstremitelerini atmak ve kesilmiş ilik bloklarını bir mililitre kaodikül tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir stereo mikroskop ve keskin bir jilet kullanın. Reçine gömme için, blokları bir kez kaktüs tamponuyla ve bir kez damıtılmış suyla yıkamadan önce, blokları dört santigrat derecede bir saat boyunca kimyasal bir başlıkta kakadodylate tamponunda% 1 osmiyum tetroksit ile sabitlayın.
Su yıkamadan sonra, blokları bir saat boyunca damıtılmış suda% 4 uranil asetat ile lekelendirin ve ardından gösterildiği gibi damıtılmış suda iki yıkama. Son yıkamadan sonra, blokları, belirtildiği gibi artan bir dizi etanol daldırma ve damıtılmış su ile susuz bırakın. İliğin içindeki epoksi reçinesinin düzgün bir infiltrasyonunu ve polimerizasyonunu elde etmek için, numuneleri oda sıcaklığında yavaş bir döner çalkalayıcıda bir saat boyunca% 100 propilen oksit ve epoksi reçine karışımında kuluçkaya yatırmadan önce blokları 15 dakika boyunca iki ardışık propilen oksit banyosunda kuluçkaya yatırın.
Kuluçkanın sonunda, aynı koşullar altında bir gecelik inkübasyon için ilik bloklarına% 100 epoksi reçinesi ekleyin, ardından iki saatlik başka bir inkübasyon için% 100 epoksi reçine ekleyin. Kuluçkanın sonunda, ilik bloklarını düz silikon kalıplarda yönlendirmek için bir mikroskop kullanın ve sonraki enine kesitlerine izin verin ve kalıpları 48 saat boyunca 60 santigrat dereceye yerleştirmeden önce epoksi reçine ile doldurun. Ultra ince kesitleme için, numune bloğunu ultra mikrotom desteğine monte edin ve desteği numune tutucuya monte edin.
Sırasıyla histolojik ve TEM analizi için enine 500 ve 100 nanometre kalınlığında bölümleri kesmek için su tankı ile donatılmış bir elmas bıçak bıçağı kullanmadan önce doku etrafındaki fazla reçineyi çıkarmak için numuneleri 45 derecelik bir açıyla kırpmak için bir elmas frezeleme kesici kullanın, ardından su yüzeyinde yüzen 500 nanometre kalınlığındaki bölümleri bir cam kaydırağa aktarmak ve 100 nanometre kalınlığında birikmiş parçaları biriktirmek için bir döngü kullanın altında kağıt filtre bulunan 200 örgü ince çubuk bakır ızgara üzerine kesitler. Toluidin mavisi boyama için, 500 nanometre kalınlığındaki bölümleri 60 derecelik bir sıcak plakaya çizdikten sonra, bir ila iki dakikalık bir kuluçka için bölümlere damıtılmış suda filtrelenmiş% 1 toluidin mavisi ekleyin. Kuluçkanın sonunda, numuneleri damıtılmış suyla yıkayın.
Slaytlar kuruduğunda, numuneleri bir kapakla monte etmek ve numuneleri hafif mikroskopi ile görüntülemek için montaj ortamını kullanın. Kontrast boyama için, 100 nanometre bölümünü beş dakika boyunca% 4 uranil asetat ve ardından damıtılmış su ile üç beş dakikalık yıkama ile etiketleyin. Son yıkamadan sonra, bölümleri üç dakika boyunca kurşun sitratla lekeleyin, ardından gösterildiği gibi damıtılmış suda üç beş dakikalık yıkama.
Son yıkamadan sonra, ızgaraların filtre kağıdına yerleştirilmesini sağlamak için önce her ızgaranın alt tarafını bir filtre kağıdı parçasıyla temas halinde yerleştirin. Bölümleri TEM'e göre incelemek için, ızgaralar kuruduğunda, preparatların genel kalitesini değerlendirmek için düşük bir büyütme seçin. Her enine bölümde olgunlaşmanın her aşamasından megakaryosit sayısını belirlemek için, daha yüksek bir büyütme seçin ve aşama I, II veya III megakaryositlerin sayısını yalnızca tamamen doku tarafından kaplanmış karelerde ölçün.
Bu temsili histolojik analizde, kompaktlık mikro kap sürekliliği ve megakaryositlerin büyüklüğü ve şekli açıkça gözlemlenebilir. Murine megakaryositleri olgunlaşmanın dört aşamasına ayrılır. Aşama I megakaryositlerin büyük bir çekirdeği vardır.
Sınır membran sisteminin en erken tespit edilebilir aşamasının varlığı da bu aşamanın önemli bir kriteridir. Evre II'de granül oluşumu başlar ve sınır membran sisteminin geliştirilmesine başlanır. Evre III megakaryositler, iyi gelişmiş sınır membran sistemlerine, açıkça tanımlanmış sitoplazmik bölgelere ve organellerden yoksun çevre bölgelerine ve eksantrik olarak yerleştirilmiş çekirdeklere sahip dev hücrelerdir.
Megakaryosit olgunlaşmasının pirenite aşaması çıplak bir çekirdek ile karakterizedir. Gösterildiği gibi, megakaryositler endotel hücreleri ile temas halinde sıklıkla gözlenir. Bazen, megakaryositler endotellere nüfuz eden kısa invaziv çıkıntılar oluştururlar veya proplateletleri sinüzoidal lümene uzatırlar.
TEM ayrıca ultra yapısal detayların görselleştirilmesine ve megakaryositler tarafından yutulan hematopoetik hücrelerin varlığına izin vermektedir. Kemik iliği kızarması dikkatli ve kemik diseksiyonu sonrası yapılmalıdır. Doku bütünlüğünü en üst düzeye çıkarmak için, ilik dehidratasyondan önce bir agar jeli ile çevrilidir.
Bu işlemden sonra kemik iliği blokları farklı büyütmelerde görüntülenebilir veya odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskopisi gibi diğer 3D elektron mikroskopisi için kullanılabilir.
