Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы наблюдать ультраструктуру мегакариоцитов, расположенных в костном мозге мыши, и количественно оценить различные стадии созревания с помощью просвечивающих электронных микроскопий с высоким разрешением. Основным преимуществом является непосредственное исследование мегакариоцитов в нативной среде, которое отличается от культивированных in vitro мегакариоцитов, которые, как известно, не достигают полного уровня созревания. После сбора большеберцовой и бедренной костей у 12-18-недельных мышей C57BL/6 в соответствии со стандартными протоколами используйте острое лезвие бритвы для удаления эпифизов из каждой кости.
Удерживая каждую кость пинцетом, вставьте иглу 21 калибра, прикрепленную к пятимиллилитровой шприц, заполненной какодилатным буфером, в один конец кости и промывайте костный мозг в 15-миллилитровую коллекторную трубку, содержащую два миллилитра свежего какодилатного буфера. Сразу после промывки используйте пластиковую пипетку для переноса цилиндров костного мозга в один миллилитр свежего фиксаторного раствора глутаральдегида для 60-минутной инкубации при комнатной температуре. Для встраивания костного мозга в агарозу промыть неподвижные образцы в свежем какодилатном буфере и использовать пластиковую пипетку, чтобы аккуратно перенести костный мозг на стеклянную горку.
Используя теплую пипетку, быстро нанесите каплю 2%-го жидкого агара на цилиндры костного мозга и сразу же поместите горку на лед на одну-две минуты. Когда агар затвердеет, используйте стереомикроскоп и острое лезвие бритвы, чтобы отбросить конечности каждого цилиндра костного мозга и перенести обрезанные блоки костного мозга в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую один миллилитр какодилатного буфера. Для встраивания смолы зафиксируйте блоки с 1% тетроксидом осмия в какодилатном буфере в химической вытяжке в течение одного часа при четырех градусах Цельсия перед промывкой блоков один раз с какодилатным буфером и один раз с дистиллированной водой.
После промывки водой окрашивайте блоки 4% уранилацетатом в дистиллированной воде в течение одного часа с последующей двумя промывками в дистиллированной воде, как показано на казано. После последней промывки обезвоживайте блоки через восходящую серию погружений этанола и дистиллированной воды, как указано. Для получения равномерной инфильтрации и полимеризации эпоксидной смолы внутри костного мозга инкубируют блоки в двух последовательных ваннах оксида пропилена в течение 15 минут перед инкубацией образцов в индивидуальной смеси 100% оксида пропилена и эпоксидной смолы в течение одного часа на медленном ротационном шейкере при комнатной температуре.
В конце инкубации добавляют 100% эпоксидную смолу в блоки костного мозга для ночной инкубации в тех же условиях, затем добавляют 100% эпоксидную смолу для еще одной инкубации в течение двух часов. В конце инкубации используйте микроскоп для ориентации блоков костного мозга в плоских силиконовых формах, чтобы обеспечить их последующее поперечное сечение и заполнить формы эпоксидной смолой, прежде чем поместить их при 60 градусах Цельсия в течение 48 часов. Для ультратонкого сечения установите блок образца на ультрамикротомную опору и установите опору на держатель образца.
Используйте алмазный фрезерный резак для обрезки образцов под углом 45 градусов, чтобы удалить избыток смолы вокруг ткани, прежде чем использовать лезвие алмазного ножа, оснащенное резервуаром для воды, для резки поперечных участков толщиной 500 и 100 нанометров для гистологического анализа и анализа ТЭМ соответственно, затем используйте петлю для переноса секций толщиной 500 нанометров, плавающих на поверхности воды, на стеклянную горку и нанесения толщины 100 нанометров секции на 200-сетчатых тонких прутках медных сеток с бумажным фильтром внизу. Для окрашивания толуидиновым синим цветом, после нанесения 500-нанометровых разрезов на конфорку с 60 градусами, добавьте фильтрованный 1% толуидиновый синий в дистиллированной воде в секции для одно-двухминутной инкубации. В конце инкубации промыть образцы дистиллированной водой.
Когда слайды высохнут, используйте монтажную среду для монтажа образцов с помощью крышки и просмотрите образцы с помощью световой микроскопии. Для контрастного окрашивания маркируют 100-нанометровые участки 4% уранилацетатом в течение пяти минут с последующей тремя пятиминутными промывками дистиллированной водой. После последней промывки окрашивайте участки цитратом свинца в течение трех минут, а затем три пятиминутные промывки в дистиллированной воде, как показано на продемонстрированном виде.
После последней стирки сначала поместите нижнюю сторону каждой сетки в контакт с листом фильтровальной бумаги, чтобы сетки можно было поместить на фильтровальную бумагу для высыхания. Для осмотра участков ТЕА, когда сетки высохнут, выберите низкое увеличение для оценки общего качества препаратов. Чтобы определить количество мегакариоцитов из каждой стадии созревания в каждом поперечном сечении, выберите более высокое увеличение и количественно оцените количество мегакариоцитов I, II или III стадии только в квадратах, которые полностью покрыты тканью.
В этом репрезентативном гистологическом анализе можно четко наблюдать непрерывность микросовидений компактности, а также размер и форму мегакариоцитов. Мышиные мегакариоциты делятся на четыре стадии созревания. Мегакариоциты I стадии имеют большое ядро.
Наличие самой ранней обнаруживаемой стадии демаркационной мембранной системы также является ключевым критерием этой стадии. На II стадии начинается гранулообразование и инициируется развитие демаркационной мембранной системы. Мегакариоциты III стадии представляют собой гигантские клетки с хорошо развитыми демаркационными мембранными системами, четко очерченными цитоплазматическими территориями и периферическими зонами, лишенными органелл, и эксцентрично расположенными ядрами.
Пиреноцитарная стадия созревания мегакариоцитов характеризуется голым ядром. Как показано на рисунке, мегакариоциты часто наблюдаются при контакте с эндотелиальными клетками. Иногда мегакариоциты образуют короткие инвазивные выступы, которые проникают в эндотелий или расширяют проплацелеты в синусоидальный просвет.
TEM также позволяет визуализировать ультраструктурные детали, а также наличие кроветворных клеток, которые были поглощены мегакариоцитами. Промывка костного мозга должна проводиться осторожно и сразу после рассечения кости. Для максимальной целостности тканей костный мозг перед обезвоживанием облагают гелем агара.
После этой процедуры блоки костного мозга могут быть визуанированы при различных увеличениях или могут быть использованы для другого анализа 3D-электронной микроскопии, такого как сфокусированная ионно-лучевая сканирующая электронная микроскопия.
