尽量减少小鼠肝内胰岛移植期间输注后门静脉出血

肝脏是人类胰岛临床环境中移植的主要部位。小鼠肝内胰岛移植在技术上具有挑战性，并且很大比例的小鼠可能死于手术并发症，尤其是出血。在这项研究中，我们展示的两种方法都可以有效预防出血引起的小鼠死亡。

我们的方法可以通过允许将癌细胞，间充质干细胞和肝细胞直接注射到肝脏中来应用于肝癌和其他肝脏疾病的研究。首先，通过轻柔的抓挠分离人类胰岛文化。使用1立方厘米注射器将300至350个小岛掰入冰上的无菌1.5毫升微量离心管中。

当所有胰岛都被采摘后，离心管10秒钟以沉淀细胞。除少量上清液外，弃去所有上清液以防止沉淀丢失，并将胰岛重悬于含有5%BSA的200微升HBSS中。将重悬的胰岛装入5毫升胰岛素注射器中，并将注射器针端向上转动1分钟，让胰岛在柱塞处沉降。

压低柱塞以除去任何气泡，在注射器中保持约100至150微升的溶液，并用轻轻敲击倒注射器以均匀分布胰岛。在确认对踏板反射缺乏反应后，将软膏涂抹在眼睛上以防止干燥。剃掉麻醉小鼠的腹部以去除毛皮，并用三个2%碘和75%酒精的交替擦拭物对手术区域进行消毒。

接下来，在腹部做一个1至1.5厘米的切口，打开腹膜腔。在切口周围放置一块无菌纱布，并使用镊子或棉签轻轻地将肠子转移到纱布上。然后用一块盐水浸泡的纱布覆盖肠道并暴露门静脉。

要使用凝胶泡沫停止胰岛转移引起的出血，请握住针头，斜面朝下，并将针尖的开口与门静脉壁平行，然后将针头插入门静脉。将柱塞缩回，将20至50微升的血液吸入注射器中，与胰岛混合，然后将胰岛注入门静脉，同时反复压低并缩回柱塞。当所有胰岛都已交付后，在注射部位放置约5×5厘米的凝胶泡沫。

使用棉签将凝胶泡沫压向下，同时将针头从门静脉中取出。将凝胶固定在适当的位置约2分钟，滚动凝胶泡沫以确保其覆盖门静脉。一旦出血停止，轻轻地将肠子放回原始位置的腹膜腔，并将500微升温盐水注入腹腔。

使用缝合线关闭肌肉和皮肤层。然后将小鼠放在加热垫上的干净笼子中，并进行监测，直到从麻醉中完全恢复，每12小时给予镇痛，加热48小时。为了使用脂肪垫停止胰岛转移引起的出血，在如图所示暴露门静脉后，使用两个棉头将暴露的静脉保持在左侧和右侧，并将脂肪组织垫定位在十二指肠和门静脉之间。

在插入门静脉之前，用针尖穿透脂肪垫。如图所示，将胰岛注入门静脉。当所有胰岛都已送达时，用棉头按压脂肪组织约1分钟，同时从静脉中取出针头。

然后将肠子放回腹腔，并执行其余的术后护理程序，如所示。胰岛移植的效果是剂量依赖性的，因为在同源胰岛移植后30天转移500个胰岛时观察到正常血糖，但当250个胰岛被递送时，仅观察到短暂的正常血糖，小鼠在移植后10天返回高血糖。两组均观察到体重增加，当人类胰岛移植到糖尿病NOD-SCID小鼠中时观察到相同的反应，当移植更多数量的胰岛当量但不小于数量时观察到正常血糖。

大多数在转移后出血的小鼠在手术后死亡，而没有出血的小鼠存活下来。在移植后28天，胰岛素染色显示人胰岛在整个肝脏中的均匀分布，主要靠近血管。除胰岛素外，在移植的人类胰岛内还观察到纤维蛋白和多形核细胞过滤。

肝内胰岛移植会在门静脉中产生一个大孔，可能导致出血。使用我们两种改进的程序可以防止出血并降低胰岛移植后的死亡率。门内胰岛移植模型可以模拟临床人胰岛移植。

我们改进的程序可以提高受者的存活率，从而允许在移植后进一步研究胰岛功能。