癌细胞具有从细胞外环境中内化营养物质（如ATP）的显着能力。我们的方案允许我们展示ATP内化并可视化细胞内的ATP定位。这种在大卵泡体内内化ATP的高分辨率成像是理解特定定位和完成内化分析量的理想选择。
该协议描述了研究ATP内化的不同实验应用。该方法可用于研究细胞内化的不同机制，包括大吞细胞增多症和外泌体介导的内吞作用。对于代谢性疾病，可以使用该协议研究非癌细胞中的ATP内化。
首先，将癌细胞接种在225平方厘米的烧瓶中，其中含有补充FBS和抗生素的DMEM。让细胞在细胞培养箱中以37摄氏度和5%二氧化碳生长。一旦达到80%汇合，分离细胞并通过离心将细胞沉淀下来分离细胞，并将细胞重悬于冰冷的PBS中，以达到每100微升PBS的5倍10至6个细胞的细胞密度。
将细胞悬浮液转移到1.5毫升微量离心管中。用75%乙醇清洁免疫缺陷小鼠侧翼的注射部位，并用精细的任务擦拭擦拭多余的乙醇。将细胞吸入一毫升无乳胶注射器中，配有27号精密滑动针。
对于皮下注射，将针头与皮肤成约10度角，并将针尖插入，斜面朝上皮肤下方，仅将针头保持在皮肤外一到两毫米。从注射器中缓慢分配细胞约10秒。注射整个体积后，将针头固定到位三到五秒钟，然后取出针头。
用手指轻柔但用力按压注射部位三到五秒钟，以防止注射内容物泄漏。使用游标卡尺监测和测量肿瘤生长，直到肿瘤达到200至500立方毫米的体积。溶解300微升每毫升16毫克高分子量荧光葡聚糖和无血清DMEM，并在水浴中孵育，在37摄氏度下回火30分钟，然后离心葡聚糖溶液并将上清液转移到新的1.5毫升微量离心管中。
在40微升下，将1毫摩尔不可水解的荧光ATP模拟物以160微升无血清DMEM，制成0.2毫摩尔不可水解的荧光ATP溶液。通过混合先前制备的储备溶液，制备DMEM或每毫升高分子量或低分子量荧光葡聚糖的8毫克处理溶液，在DMEM中具有或不具有100微摩尔不可水解荧光ATP。使用一毫升注射器收集50微升的一个处理溶液。
将溶液直接注射到异种移植物肿瘤中，并重复每次治疗的四次生物重复。安乐死小鼠并分离肿瘤组织后，使用穿孔勺子舀起切除的肿瘤组织，并立即将组织放入冷冻培养基中并滚动组织，确保组织保持浸没在培养基浴中，所有组织表面。小心地将组织放入含有冷冻介质的包埋模具中。
将相应的标签标签垂直放入冷冻介质或模具中，确保书写的标签在介质外可见。当冷冻介质变成不透明的白色时，从模具中取出组织块，将组织块放在干冰上，并对每个肿瘤部分重复冷冻。在冷冻切除程序之前，将组织块在零下80摄氏度下储存数月。
制作组织块的载玻片后，将组织切片在零下18摄氏度下用95%乙醇固定五分钟。用PBS清洗固定部分五分钟。根据切片的大小，将10至50微升带有DAPI的水性安装介质加入到组织切片中，并在组织切片上放置玻璃盖玻片。
安装12至24小时后，确定固定肿瘤切片的感兴趣区域，并使用荧光显微镜获取图像，如前所述。在人体肿瘤细胞固定2至24小时后，使用落射成像系统和数据采集软件捕获图像。将载玻片放在双目模式下直立表层花显微镜的载物台上。
打开成像程序，选择10倍物镜并调整载物台以定义焦点。以蜿蜒的方式从左到右扫描幻灯片，以确定感兴趣的区域。选择40倍物镜，然后使用显微镜上的开关从双目切换到图像捕获模式。
单击实时质量图标以查看并随后获取图像。使用采集工具栏上的 OC 面板定义每个滤光片立方体或荧光灯通道的曝光参数，然后使用多通道采集工具栏以定义的曝光设置采集三通道图像。或者，可以通过在滤光片立方体之间切换，设置曝光时间，在每个通道的图像采集之间关闭或打开快门以及叠加为单个通道拍摄的每个图像来手动获取多通道图像。
将图像另存为 nd2 文件。保存 TIF 文件，包括合并的频道图像和单个频道图像。使用注释和测量工具栏上的对象计数功能，在保存的nd2图像文件上计算NHF-ATP，TMR高分子量荧光葡聚糖和TMR低分子量荧光葡聚糖阳性细胞的数量，并通过分析程序将数据导出到电子表格。
该协议是为不可水解ATP的细胞内化的空间，时间和定量分析而开发的。通过在体外，离体和体内将不可水解荧光ATP与高分子量或低分子量荧光葡聚糖共定位来证明不可水解荧光ATP的细胞内化。为确保肿瘤细胞保留内化ATP，限制所有肿瘤内注射至冷冻包埋的实验时间。
还通过对整个肿瘤中的组织进行成像来解释肿瘤内变异。我们方法的未来迭代可能涉及E-ATP内化过程的实时可视化，揭示有关大型胞浆细胞动力学和特定组织运输的信息。
