我们的 FRET 探头和协议能够快速、敏感地量化嗜中性气道疾病患者在痰中的自由和表面绑定 elastase 和导管 G 活性。这些方法，使得探索蛋白酶病理生理学的不同方面成为可能。板阅读器测量允许进行大排量筛选。
共聚焦显微镜可视化酶活性与亚细胞溶液。在流动细胞测量的同时，以个性化的方式实现单细胞表型和蛋白酶活性定量。该技术可扩展到不同的气道疾病，如囊性纤维化、支气管切除术或慢性阻塞性肺病。
它可以适应不同的生物样本，如血液或支气管牛皮或小鼠样本。在开始痰诱导程序之前，吸入200微克β2受体拮抗剂沙丁胺醇。之后，使用雾化器吸入高音6%盐溶液15分钟。
在培养皿中收集预期的痰。在移液器尖的帮助下，将唾液中的粘液团块分离到培养皿中。称重粘液，然后在痰中加入四个体积部分，每重量为 10%的痰素和 PBS。
在室温下将混合物在摇动摇床上孵育15分钟，溶解粘液。通过为每毫升10%的斯普托利辛添加一毫升冷PBS来抑制反应。派珀特混合物获得同质溶液。
通过100微米尼龙细胞过滤器将混合物过滤成50毫升管。在 4 摄氏度的 300 倍 G 下，通过 40 微米滤网重复过滤步骤，然后离心机在 300 倍 G 下 10 分钟。将超自然人转移到一个新的管子里，并储存在冰上。
轻轻地将细胞颗粒在 500 微升的冷 PBS 中恢复，并将其放置在冰上。解冻冰上的酶，并设置文本手稿中描述的酶标准曲线。在标准制备的同时，在激活缓冲中稀释痰样。
在读板器上，为NE FRET探头NEmo-1至354纳米设置激发波长，为供体设置发射波长至400纳米，为接受者设置490纳米的激发波长。对于CG FRET探测器，SSam将激发波长设置为405纳米，为供体设置发射波长为485纳米，为接受者设定580纳米。将 40 微升样品、标准或空白添加到黑色 96 井半区域板的井中，并添加主混合。
启动读板器并记录捐赠者接受者比率每 60 到 90 秒后增加至少 20 分钟，或直到信号增加达到高原。导出数据并计算捐赠者与接受者的比例，将捐赠者 RFU 除以每个时间点和样本的接受者 RFU。然后计算捐赠者与接受者比率的均值和标准偏差。
确定捐赠者与接受者比率变化的线性增长中的坡度。每次测量，在1.5毫升的管中，在50微升PBS的体积中再补充3万个痰细胞。用特定抑制剂作为负控制和适当的酶作为阳性控制，在室温下孵化痰细胞10分钟。
在每个管子上加入50微升PBS，其中含有FRET记者和核污渍，最终浓度为2微摩尔。在室温下孵化混合物10至20分钟。通过添加100微升冰冷PBS并将样品放在冰上来抑制反应。
在显微镜幻灯片上将混合物切入。然后空气干燥，用冰冷的10%甲醇固定细胞10分钟。固定后，空气干燥，并安装样品与适当的安装介质。
使用对焦显微镜捕捉图像。图像至少100个细胞每个条件，以决定性的统计。在5毫升FACS聚苯乙烯圆底管中，在100微升PBS中补充100万个细胞，并将管子放在冰上。
在每个样品中添加两个 FC 块的微升。然后在室温下将样品孵化五分钟。每根管子加入抗体，在黑暗中在冰上孵育30分钟。
在 300 倍 G 和 4 摄氏度下用两毫升的冷 PBS 和离心机清洗细胞。最后，在PBS的200微升中恢复。将悬架分成两个管子，每个管子100微升，并添加5个微升的细胞生存性污渍。
在负控制管中加入适当的特定 NSP 抑制剂，并在黑暗中的室温下将样品孵育 10 分钟。将 PBS 添加到样品中，并通过 40 微米滤芯将其过滤到干净的 FACS 管中。将记者添加到负控制样本中，轻轻漩涡。
开始获取使用这种特定抑制剂孵育的细胞，如有必要，稍微调整门以及记者PMTs电压。要记录捐赠者接受因膜绑定蛋白酶活性而发生的比例的变化，每5至10分钟记录1000个来自每个管子的嗜中性粒细胞。通过将捐赠者除以接受者通道值来计算在门控可行单嗜中性粒细胞上测量的样本的 FRET 比率。
此处显示了用 100 微摩尔西维利斯塔特预先孵育的嗜中性粒细胞图像，或在记者 NEmo-2 添加之前未得到处理的图像。核信号用于根据中微子的特征分段核来识别中性粒细胞，并手动选择投资回报率。绘制了接受痰中性粒细胞比例的捐赠者。
每个点表示一个投资回报率的平均值。流动细胞测量门控使歧视和研究痰中性粒细胞成为可能。记者加法后观察到的MFI分布为零和10分钟。
计算了1000个痰中性粒细胞的平均供体和接受者MFI值。D/A比率在初始增加后达到稳定值。健康的捐赠者痰诱导需要一些实践之前完美。
记得在预料到之前放松和呼吸气溶胶10到15分钟。此外，始终将痰细胞保存在冰上，并在预料到后尽快处理。我们发现，表面绑定蛋白酶活动与儿童早期肺损伤和成年CF患者肺部疾病的严重程度有关。
因此，这些方法共同有助于探索蛋白酶作为中性嗜血性气道疾病的早期炎症生物标志物。
