测量CD95死亡诱导信号传导复合物的组成和该复合物中Procaspase-8的处理

凋亡的开始是通过在标记分子平台上激活半胱天冬酶介导的。我们提出了关键起始细胞死亡复合物DISC的检测，其作为半胱天冬酶-8激活的平台。该技术的优点是它允许检测DISC复合物的组装和组成，同时提供有关该复合物中caspase-8处理的信息。

用80%至90%汇合并粘附在培养皿上的细胞开始实验。丢弃培养基并将新鲜培养基加入贴壁细胞中。然后通过以一定角度保持板并将配体移液到培养基中而不接触贴壁细胞来刺激具有选定浓度的CD95L的细胞。

要收获细胞，请将细胞培养皿放在冰上。向细胞悬浮液中加入10毫升冷PBS，并将附着的细胞从板上刮下。将细胞悬浮液收集在50毫升管中。

用10毫升冷PBS洗涤细胞皿两次，并将洗涤溶液加入相同的50毫升管中。然后将细胞悬浮液以500倍G在四摄氏度下离心五分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于一毫升冷PBS中。

然后将细胞悬浮液转移到1.5毫升的管中。离心细胞悬浮液，并再次将细胞沉淀重悬于一毫升冷PBS中。再次重复离心，然后将细胞沉淀重悬于一毫升裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟。

孵育后，以最大速度在4摄氏度下离心裂解物15分钟，然后将上清液转移到干净的管中。丢弃沉淀并在另一个管中收集50微升裂解物样品以确定蛋白质浓度。对于免疫沉淀，向裂解物中加入2微升抗APO1抗体和10微升制备的蛋白A琼脂糖珠。

将10微升的微升磁珠单独加入含有裂解物的单独管中，以用作微珠对照。将含有裂解物，抗体和蛋白质A的混合物在4摄氏度下孵育过夜，并轻柔混合。第二天，将混合物以500倍G在四摄氏度下离心四分钟。

弃去上清液后，通过加入一毫升冷PBS洗涤珠子，并在离心后丢弃上清液。至少重复此步骤三次。丢弃最后一次PBS洗涤后，最好用50微升Hamilton注射器吸出珠子。

要进行蛋白质印迹，向磁珠中加入20微升4X加载缓冲液，并在95摄氏度下加热10分钟。同时，将裂解物对照在95摄氏度下加热五分钟。将裂解物、免疫沉淀剂和蛋白质标准品上样到 12.5% SDS 凝胶上，并以 80 伏的恒定电压电泳。

凝胶电泳完成后，将蛋白质从SDS凝胶转移到硝酸纤维素膜上。转移完成后，将转印膜放入盒子中，在轻柔搅拌下将其在封闭溶液中孵育一小时，然后用PBST洗涤膜三次，持续五分钟。为了检测蛋白质，将第一个一抗以指示的稀释液加入膜中，并在四摄氏度下以轻柔搅拌孵育过夜。

第二天，用三次五分钟的PBST洗涤膜，然后用20毫升二抗孵育膜，在室温下轻轻摇动一小时。再次用PBST洗涤膜三次。丢弃最后一次PBST洗涤后，向膜中加入约一毫升辣根过氧化物酶底物并检测化学发光信号。

用CD95L刺激宫颈癌HeLa-CD95细胞导致通过CD95免疫沉淀监测高水平的CD95 DISC形成。在这些CD95免疫沉淀中观察到CD95，FADD，procaspase-8，procaspase-10和c-FLIPS，表明DISC形成有效。在免疫沉淀中检测到p43-FLIP和p22-FLIP的裂解产物，表明半胱天冬酶-8活化。

用于分析CD95 DISC形成的过度表达c-FLIP长的HeLa-CD95细胞。与亲本HeLa-CD95细胞类似，在没有CD95L处理的情况下，在这些细胞的免疫沉淀中未检测到FAD，procaspase-9，procaspase-10，c-FLIP蛋白和PARP1的募集。活化的原代T细胞在抗CD95免疫沉淀物中具有高水平的CD95，FADD，procaspase-8，procaspase-10和c-FLIPS。

该技术允许分析分子DISC的形成，包括在DISC处理CASPASE-8。所有洗涤步骤都非常重要。此外，应认真对待刺激点和潜伏时间。

这是测量DISC复合物上组件的唯一方法。然而，为了测量半胱天冬酶-8活化，还可以实施半胱天冬酶-8活性测定。这种方法使我们能够获得对细胞凋亡起始的新见解。