Dieses Protokoll maximiert die Leistungsfähigkeit der Mikroskopie als Methode zur Verfolgung der mitochondrialen Dynamik innerhalb einzelner Zellen über lange Erfassungszeiträume erheblich. Im Gegensatz zum Zeitraffer bei einer festen Gruppe von Zellen oder bei jeweils einer Zelle steuert die Normalisierung auf eine Baseline für jedes gemessene Kriterium in jeder Zelle die Heterogenität zwischen den Zellen. Mit einem Mikroskop, das mit einer automatisierten Plattform und einem angepassten viralen Vektor ausgestattet ist, können wir dieses Protokoll für jeden Zelltyp verwenden.
Beginnen Sie mit der Beschichtung von 20.000 bis 25.000 Zellen pro Quadratzentimeter in Multi-Well-Schalen und lagern Sie sie bei 37 Grad Celsius unter einer Atmosphäre, die 5% Kohlendioxid für den Rest des Experiments enthält. Nach acht Tagen in vitro 0,6 Pikogramm P24-Antigen pro Zelle des lentiviralen Vektors hinzufügen, der für den mitochondrialen Biosensor MitoTimer kodiert, der in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt ist. Führen Sie nach 11 Tagen in vitro zwei Wäschen mit vorgewärmtem sterilem PBS durch und fügen Sie frisches Astrozytenmedium ohne Phenolrot hinzu.
Beurteilen Sie das astrozytäre mitochondriale System mindestens drei bis fünf Tage nach den lentiviralen Infektionen mit LV-G1 MitoTimer. Wählen Sie fünf Astrozyten pro Vertiefung mit einem mitochondrialen Netzwerk, das ausreichende Mengen an LV-G1 MitoTimer mit einer 40-fachen Vergrößerung ausdrückt. Achten Sie darauf, Astrozyten flach und groß wie möglich auszuwählen und sich nicht in Zellhaufen zu befinden.
Erfassen Sie dann Fluoreszenzbilder mit sequentieller Anregung bei 490 Nanometern für den grünen Kanal und 550 Nanometern für den roten Kanal mit grünen und roten Fluoreszenzsignalen und mit einer Vergrößerung von 150 mal für jede Koordinate. Wählen Sie den ersten Frame für rote und grüne Kanäle für jede Bildsequenz aus, indem Sie auf ND Processing klicken und Frame auswählen. Führen Sie dann den roten und den grünen Kanal zusammen, indem Sie Conversions und Merge-Kanal auswählen.
Um die Bildschattierung zu korrigieren, wählen Sie Vorverarbeitung und dann automatische Schattierungskorrektur. Wenden Sie den Rolling Ball-Algorithmus an, indem Sie Pre-Processing und Rolling Ball auswählen. Um binäre Masken für jedes Mitochondrium zu generieren, wählen Sie Segmentierung und Schwellenwert.
Entfernen Sie alle Objekte, die durch den Rahmen abgeschnitten sind, indem Sie binäre Verarbeitung auswählen und den Rahmen berühren. Wählen Sie Messung und dann Objektbereich, EEQ-Durchmesser, Länge, Breite, Rauheit, Zirkularität oder Dehnung aus, um Oberfläche, Durchmesser, Länge, Breite, Rauheit, Zirkularität oder Dehnung zu messen. Stellen Sie eine Gruppe mit diesen Messungen zusammen und benennen Sie sie in MOFO-Daten um.
Wählen Sie dann Messung und dann mittlere Intensität aus, um die mittleren grünen und roten Intensitäten zu messen. Und Verhältnis, um das Verhältnis von Rot zu Grün zu messen. Gruppieren Sie nun composer mit diesen Messungen und benennen Sie sie in Verhältnisdaten um.
Exportieren Sie schließlich die Tabelle in eine CSV-Datei, indem Sie Referenz und Tabelle in CSV auswählen, und speichern Sie dann das GA 3-Analyseskript, indem Sie Speichern unter auswählen.Beginnen Sie, indem Sie das Tracking-Modul in NIS öffnen und Ansicht, Analyse und Nachverfolgung auswählen. Klicken Sie auf Neuen ROI definieren. Wählen Sie mit dem automatischen Erkennungstool 25 bis 50 Mitochondrien auf dem ersten Bild der Bildsequenz aus und klicken Sie dann auf Automatisch erkannte ROIs-Analyse verfolgen.
Löschen Sie ggf. die falschen ROI-Tracks und exportieren Sie die Tabelle in eine CSV-Datei. Protokollieren Sie die Transformation der Messungen vor der Verarbeitung manuell. Normalisieren Sie für jede Analyse und jeden Zeitrahmen manuell die resultierenden Daten durch den Mittelwert, der in der Referenzerfassung erhalten wurde.
Führen Sie dann eine statistische Analyse durch, indem Sie eine bidirektionale Übereinstimmung mit einem Nova durchführen. Die Primärkultur von Astrozyten, die mit LV-G1 MitoTimer infiziert waren, zeigte reduzierte ausgewogene und oxidierte mitochondriale Netzwerke mit unterschiedlichen Fragmentierungsgraden. Vor der Wasserstoffperoxidbehandlung zeigten Astrozyten, die LV-G1 MitoTimer exprimierten, eine heterogene mitochondriale Größe in verschiedenen grünen und roten Fluoreszenzintensitäten.
Die mitochondriale Morphologie von Astrozytenkulturen wurde nach sechsstündiger Inkubation mit Wasserstoffperoxid fragmentiert. Es war noch offensichtlicher 12 Stunden nach der Behandlung ohne ihre Durchmesser mit seitdem Sphäroizitätsreduktion. In Bezug auf Redoxzustand und Umsatz stieg drei Stunden nach einer Wasserstoffperoxidbehandlung der Anteil der grünen Mitochondrien in Astrozyten an.
Bezüglich der Dynamik und Mobilität drei Stunden nach der Behandlung. Alle Kriterien wurden vorübergehend erhöht. Diese Technik eignet sich für viele verschiedene Fragestellungen.
Zum Beispiel untersuchen wir im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen die estrozytäre Toxizität verschiedener Moleküle, die im Gehirn sezerniert werden.
