用于合成生物学和天然产物应用的高产 链霉菌 转录翻译工具包

我们的实验方案为委内瑞拉链霉菌无细胞转录翻译提供了简化的工作流程。我们的系统利用来自这种非模式生物的代谢酶和途径。主要优点是高GC含量基因的异源表达，提供有利的蛋白质转发环境，以及用于微调生物合成途径的开放系统。

我们的方法将为研究链霉菌和相关的高GC细菌开辟新的机会。它允许研究这些细菌中的酶和基因表达。开发此技术是为了便于新用户实施而开发的。

需要事先经验或熟悉的唯一步骤是超声处理以生产高活性的粗提取物。要在第三天开始收获预培养的细胞，用新鲜的GYN培养基以1比10的比例稀释过夜培养物，以在600纳米处进行光密度或OD测量。如果培养物在600纳米处的OD小于0.3，则将振荡速度增加到每分钟250至300次旋转并生长直至OD达到0.3。

再生长不超过两个小时。如果OD大于0.3，将培养物转移到离心容器中，并在湿冰上快速冷却30分钟。在等待细胞培养物冷却的同时，准备四毫升新鲜的一摩尔二硫磷脂醇，S30A和S30B缓冲液，并将它们保持在冰上。

称量空的50毫升离心管后，在零下20摄氏度下预冷。将两毫升一摩尔二硫磷脂醇加入冰上一升S30A缓冲液中并充分混合。将细胞以6， 000倍G在4摄氏度下离心10分钟。

快速丢弃上清液后，加入250毫升S30A缓冲液，并通过剧烈摇动离心瓶直到细胞团块均匀分散来重悬细胞。然后再次离心细胞六分钟。离心后，弃去上清液并重复加入S30A缓冲液，然后进行离心，如图所示。

接下来，将两毫升一摩尔DTT加入冰上的一升S30B缓冲液中并充分混合。向细胞中加入250毫升S30B缓冲液并重复离心。将细胞沉淀重悬于10毫升S30B缓冲液中，并将细胞悬浮液转移到预称量的预冷50毫升离心管中。

如果需要，用额外的5至10毫升S30B缓冲液转移残留细胞，并用S30B将试管填充至50毫升体积。离心细胞10分钟。弃去上清液，并在先前的设置下重复离心，如图所示。

弃去上清液后，用100至200微升移液管吸出剩余的S30B上清液并称量湿细胞沉淀。对于每一克湿细胞，加入0.9毫升S30B缓冲液。使用巴斯德移液器或涡旋重悬细胞。

短暂离心约10秒至500 G以沉淀细胞。将超声器尖端降低到细胞悬浮液中，直到尖端低于液体表面约一厘米。在声波器设置中输入不同的参数。

将频率设置为 20 千赫兹，振幅设置为 65%脉冲打开和关闭时间设置为 10 秒，总超声处理时间设置为 1 分钟。开始超声处理，并在前两个静息周期中向上或向下和向侧面移动管子，以确保细胞均匀超声处理。如果细胞没有完全裂解，将管倒置两到三次，并重复超声处理一到两个额外的10秒循环，并频繁混合，直到细胞完全被破坏。

离心裂解细胞以除去细胞碎片，然后将上清液转移到1.5毫升微量离心管中，作为一毫升等分试样。对于细胞提取物的径流反应，在没有振荡器的加热块或培养箱中，将含有细胞提取物的细胞在30摄氏度下孵育60分钟。对于转录 - 翻译反应，在冰上解冻细胞提取物SMM或MES溶液和质粒DNA。

在零下20摄氏度下预冷384孔板。在冰上建立转录 - 翻译反应，其中25%的体积是质粒DNA，33.33%是细胞提取物，41.67%是SMM溶液。以低速设置轻轻涡旋混合物约五秒钟，以确保溶液均匀，同时避免起泡或气泡形成。

将三个10微升等分试样转移到384孔板的三个孔中，作为技术一式三份，不引入气泡。用透明盖密封板后，以400倍G旋转板五秒钟，并在培养箱或读板器中以28摄氏度孵育反应而不摇晃。针对pTU1-A-SP44标准质粒荧光蛋白的高产量表达以及通过凝胶电泳检测的生物合成酶，对委内瑞拉链霉菌无细胞转录翻译进行了优化。

使用多种方法测定pTU1-A-SP44-mScarlet-I标准质粒的表达。采用dBroccoli RNA适配体对mRNA、使用FlAsH标签系统进行未成熟的mScarlet-I蛋白和成熟mScarlet-I蛋白的实时荧光测量。除了对总无细胞蛋白进行考马斯蓝染色外，还使用FlAsH标签对mScarlet-I进行了凝胶内荧光染色。

按照这个程序，可以进行活性测定，以研究使用标准方法具有挑战性的酶和途径。它还扩展到扩大生物合成和高通量基因表达。我们正在开发这种技术来研究高GC细菌的代谢酶。

我们已经展示了我们的系统在研究无细胞反应中扩大生物合成的潜力。