Наш протокол обеспечивает упрощенный рабочий процесс для Streptomyces venezuelae бесклеточной транскрипции-трансляции. Наша система использует метаболические ферменты и пути этого немодельного организма. Основными преимуществами являются гетерологичная экспрессия генов с высоким содержанием ГК, обеспечение благоприятной среды пересылки белка, открытая система тонкой настройки биосинтетических путей.
Наш метод откроет новые возможности в изучении Streptomyces и связанных с ними бактерий с высоким содержанием ГК. Это позволяет изучать ферменты и экспрессию генов у этих бактерий. Эта методика была разработана для удобства внедрения новыми пользователями.
Единственным шагом, который требует предварительного опыта или ознакомления, является обработка ультразвуком для получения высокоактивных сырых экстрактов. Чтобы начать сбор предварительно культивируемых клеток на третий день, разбавьте культуру на ночь в соотношении один к 10 свежей средой гинекологии для измерения оптической плотности или OD на 600 нанометров. Если ОД культуры при 600 нанометрах меньше 0,3, увеличьте скорость встряхивания до 250-300 оборотов в минуту и увеличивайте до тех пор, пока ОД не достигнет 0,3.
Расти не дольше двух дополнительных часов. Если ОД больше 0,3, переложите культуры в емкости для центрифугирования и быстро охладите на влажном льду в течение 30 минут. Ожидая, пока клеточная культура остынет, приготовьте четыре миллилитра свежих один молярный буфер дитиотрейтол, S30A и S30B и держите их на льду.
После взвешивания пустой 50-миллилитровой центрифужной трубки предварительно охладите ее при минус 20 градусах Цельсия. Добавьте два миллилитра одного молярного дитиотрейтола в один литр буфера S30A на льду и хорошо перемешайте. Центрифугируйте клетки в 6 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
После быстрого отбрасывания супернатанта добавьте 250 миллилитров буфера S30A и повторно суспендируйте клетки, энергично встряхивая бутылки центрифугирования до тех пор, пока сгустки клеток не будут однородно диспергированы. Затем снова центрифугируйте клетки в течение шести минут. После центрифугирования отбросьте супернатант и повторите добавление буфера S30A с последующим центрифугированием, как показано на рисунке.
Далее добавьте два миллилитра одного молярного DTT к одному литру буфера S30B на льду и хорошо перемешайте. Добавьте 250 миллилитров буфера S30B в ячейки и повторите центрифугирование. Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 10 миллилитрах буфера S30B и перенесите клеточную суспензию в предварительно взвешенную предварительно охлажденную 50-миллилитровую центрифужную трубку.
При необходимости переложите остаточные ячейки с дополнительными пятью-10 миллилитрами буфера S30B и заполните трубку до объема 50 миллилитров S30B. Центрифугируйте клетки в течение 10 минут. Отбросьте супернатант и повторите центрифугирование на предыдущих настройках, как показано на рисунке.
После выброса супернатанта аспирируйте оставшийся супернатант S30B пипеткой от 100 до 200 микролитров и взвесьте гранулу влажной ячейки. На каждый грамм влажных клеток добавьте 0,9 миллилитра буфера S30B. Повторное суспендирование клеток с помощью пипетки Пастера или вихря.
Центрифугируют ненадолго в течение примерно 10 секунд до 500 Г для осаждения клеток. Опустите наконечник ультразвуковика в клеточную суспензию до тех пор, пока наконечник не окажется примерно на один сантиметр ниже поверхности жидкости. Введите различные параметры в настройках ультразвукового аппарата.
Установите частоту 20 килогерц, амплитуду до 65% времени включения и выключения импульса до 10 секунд и общее время обработки ультразвуком до одной минуты. Начните обработку ультразвуком и перемещайте трубку вверх или вниз и вбок в течение первых двух циклов покоя, чтобы обеспечить равномерное использование ультразвуком клеток. Если клетки не полностью лизированы, инвертируйте трубку два-три раза и повторяйте обработку ультразвуком в течение дополнительных одного или двух 10-секундных циклов с частым перемешиванием до тех пор, пока клетки не будут полностью разрушены.
Центрифугируйте лизированные клетки для удаления клеточного мусора, затем перенесите супернатант в 1,5-миллилитрную микроцентрифужную трубку в виде одной миллилитровой аликвоты. Для реакции стока клеточных экстрактов инкубируют клетку, содержащую клеточный экстракт, при 30 градусах Цельсия в течение 60 минут на тепловом блоке или в инкубаторе без шейкера. Для транскрипционно-трансляционной реакции разморозьте клеточный экстракт SMM или MES раствор и плазмидную ДНК на льду.
Предварительно охладите 384-луночную плиту при минус 20 градусах Цельсия. Настройте реакцию транскрипции-трансляции на льду, где 25% объема составляет плазмидная ДНК, 33,33% - клеточный экстракт и 41,67% - SMM-раствор. Осторожно вращайте смесь в течение примерно пяти секунд на низкой скорости, чтобы убедиться, что раствор однородный, избегая вспенивания или образования пузырьков.
Перенесите три аликвоты по 10 микролитров в три скважины из 384-луночной плиты в качестве технического трипликата без введения пузырьков воздуха. После запечатывания пластины прозрачной крышкой вращайте пластину в 400 раз G в течение пяти секунд и инкубируйте реакцию при 28 градусах Цельсия либо в инкубаторе, либо в считывателе пластин без встряхивания. Streptomyces venezuelae бесклеточная транскрипция-трансляция была оптимизирована для экспрессии флуоресцентных белков с высоким выходом из стандартной плазмиды pTU1-A-SP44, а также биосинтетических ферментов, обнаруженных с помощью гелевого электрофореза.
Экспрессию стандартной плазмиды pTU1-A-SP44-mScarlet-I измеряли с помощью нескольких методов. Были проведены измерения флуоресценции мРНК в режиме реального времени с использованием аптамера РНК dBroccoli, незрелого белка mScarlet-I с использованием системы меток FlAsH и зрелого белка mScarlet-I. Флуоресцентное окрашивание mScarlet-I с использованием метки FlAsH проводилось в дополнение к окрашиванию Coomassie Blue всего бесклеточного белка.
После этой процедуры могут быть выполнены анализы активности для изучения ферментов и путей, которые являются сложными с использованием стандартных методов. Это также распространяется на расширение биосинтеза и высокую пропускную экспрессию генов. Мы разрабатываем эту методику для изучения метаболических ферментов из бактерий с высоким содержанием ГК.
Мы показали потенциал нашей системы для изучения расширенного биосинтеза в бесклеточных реакциях.
