Nuestro protocolo proporciona un flujo de trabajo simplificado para Streptomyces venezuelae transcripción-traducción libre de células. Nuestro sistema aprovecha las enzimas metabólicas y las vías de este organismo no modelo. Las principales ventajas son la expresión heteróloga de genes con alto contenido de GC, la provisión de un entorno favorable de reenvío de proteínas y un sistema abierto para el ajuste fino de las vías biosintéticas.
Nuestro método abrirá nuevas oportunidades para estudiar Streptomyces y las bacterias relacionadas con el alto GC. Permite estudiar las enzimas y la expresión génica en estas bacterias. Esta técnica ha sido desarrollada para facilitar su implementación por parte de los nuevos usuarios.
El único paso que requiere experiencia previa o familiarización es la sonicación para producir extractos crudos altamente activos. Para comenzar a cosechar las células precultivadas al tercer día, diluya el cultivo durante la noche en la proporción de uno a 10 con un medio GINEC nuevo para la densidad óptica o la medición de OD a 600 nanómetros. Si el OD del cultivo a 600 nanómetros es inferior a 0,3, aumente la velocidad de agitación a 250 a 300 rotaciones por minuto y crezca hasta que un OD alcance 0,3.
Crecer por no más de dos horas adicionales. Si la OD es mayor que 0,3, transfiera los cultivos a recipientes de centrifugación y enfríe rápidamente sobre hielo húmedo durante 30 minutos. Mientras espera que el cultivo celular se enfríe, prepare cuatro mililitros de ditiotrereitol molar fresco, tampones S30A y S30B y manténgalos en hielo.
Después de pesar un tubo de centrífuga vacío de 50 mililitros, enfríelo previamente a menos 20 grados centígrados. Agregue dos mililitros de un ditiotreitol molar a un litro de tampón S30A en hielo y mezcle bien. Centrifugar las células a 6.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de desechar el sobrenadante en un movimiento rápido, agregue 250 mililitros de tampón S30A y vuelva a suspender las células agitando las botellas de centrifugación vigorosamente hasta que los grupos celulares se dispersen homogéneamente. Luego centrifugue las células nuevamente durante seis minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y repita la adición del tampón S30A, seguido de la centrifugación como se ha demostrado.
A continuación, agregue dos mililitros de TDT molar a un litro de tampón S30B en hielo y mezcle bien. Agregue 250 mililitros de tampón S30B a las celdas y repita la centrifugación. Resuspender el pellet de celda en 10 mililitros de tampón S30B y transferir la suspensión de la celda al tubo de centrífuga de 50 mililitros pre-pesado pre-enfriado.
Si es necesario, transfiera las celdas residuales con un volumen adicional de cinco a 10 mililitros de tampón S30B y llene el tubo a un volumen de 50 mililitros con S30B. Centrifugar las células durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y repita la centrifugación en los ajustes anteriores como se ha demostrado.
Después de desechar el sobrenadante, aspire el sobrenadante S30B restante con una pipeta de 100 a 200 microlitros y pese el pellet de celda húmeda. Por cada gramo de células húmedas, agregue 0.9 mililitros de tampón S30B. Resuspend las células usando una pipeta Pasteur o un vórtice.
Centrifugar brevemente durante unos 10 segundos hasta 500 G para sedimentar las células. Baje la punta del sonicador en la suspensión celular hasta que la punta esté aproximadamente un centímetro por debajo de la superficie líquida. Introduzca diferentes parámetros en la configuración del sonicador.
Ajuste la frecuencia a 20 kilohercios, la amplitud al 65% del tiempo de encendido y apagado del pulso a 10 segundos y el tiempo total de sonicación a un minuto. Comience la sonicación y mueva el tubo hacia arriba o hacia abajo y hacia los lados durante los dos primeros ciclos de reposo para asegurarse de que las células estén sonicadas uniformemente. Si las células no están completamente lisadas, invierta el tubo dos o tres veces y repita la sonicación durante uno o dos ciclos adicionales de 10 segundos con una mezcla frecuente hasta que las células se interrumpan por completo.
Centrifugue las células lisadas para eliminar los restos celulares, luego transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros como una alícuota de mililitros. Para la reacción de escorrentía de los extractos celulares, incube la célula que contiene el extracto celular a 30 grados Celsius durante 60 minutos en un bloque de calor o en la incubadora sin un agitador. Para la reacción de transcripción-traducción, descongele el extracto celular SMM o la solución MES y el ADN plásmido en hielo.
Pre-enfriar una placa de 384 pocillos a menos 20 grados centígrados. Configure la reacción de transcripción-traducción en el hielo donde el 25% del volumen es ADN plásmido, el 33,33% es extracto celular y el 41,67% es solución SMM. Vórtice suavemente la mezcla durante unos cinco segundos a una velocidad de ajuste a baja velocidad para asegurarse de que la solución sea homogénea y evite la formación de espuma o burbujas.
Transfiera tres alícuotas de 10 microlitros a tres pozos de una placa de 384 pocillos como triplicado técnico sin introducir burbujas de aire. Después de sellar la placa con una cubierta transparente, gire la placa a 400 veces G durante cinco segundos e incube la reacción a 28 grados centígrados, ya sea en una incubadora o en un lector de placas sin agitar. Streptomyces venezuelae transcripción-traducción libre de células se optimizó para la expresión de alto rendimiento de proteínas fluorescentes del plásmido estándar pTU1-A-SP44, así como enzimas biosintéticas detectadas por electroforesis en gel.
La expresión del plásmido estándar pTU1-A-SP44-mScarlet-I se midió utilizando varios métodos. Se llevaron a cabo las mediciones de fluorescencia en tiempo real del ARNm utilizando el aptámero de ARN dBroccoli, la proteína mScarlet-I inmadura utilizando el sistema de etiquetas FlAsH y la proteína mScarlet-I madura. La tinción de fluorescencia en gel de mScarlet-I utilizando la etiqueta FlAsH se realizó además de la tinción de Coomassie Blue de la proteína libre celular total.
Después de este procedimiento, se pueden realizar ensayos de actividad para estudiar enzimas y vías que son desafiantes utilizando métodos estándar. También se extiende hacia la biosíntesis ampliada y la expresión génica de alto rendimiento. Estamos desarrollando esta técnica para estudiar las enzimas metabólicas de las bacterias de alto GC.
Hemos demostrado el potencial de nuestro sistema para estudiar la biosíntesis ampliada en reacciones libres de células.
