Nosso protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para estreptomíceos venezuelanos de transcrição livre de células. Nosso sistema aproveita as enzimas metabólicas e caminhos deste organismo não-modelo. As principais vantagens são a expressão heteróloga de genes com alto teor de GC, a provisão de um ambiente favorável de encaminhamento de proteínas e um sistema aberto para ajuste fino de vias biossintéticas.
Nosso método abrirá novas oportunidades para estudar Estreptomia e bactérias GC relacionadas. Permite estudar enzimas e expressão genética nessas bactérias. Esta técnica foi desenvolvida para facilitar a implementação por novos usuários.
O único passo que requer experiência prévia ou familiarização é a sônicação para produzir extratos brutos altamente ativos. Para começar a colher as células pré-cultivadas no terceiro dia, dilui a cultura da noite para o dia na proporção de um a 10 com um meio gineticamente fresco para a densidade óptica ou medição de OD em 600 nanômetros. Se o OD da cultura em 600 nanômetros for inferior a 0,3, aumente a velocidade de agitação para 250 a 300 rotações por minuto e cresça até que um OD atinja 0,3.
Cresça por mais de duas horas adicionais. Se o OD for maior que 0,3, transfira as culturas para recipientes de centrifugação e esfrie rapidamente no gelo molhado por 30 minutos. Enquanto espera que a cultura celular esfrie, prepare quatro mililitros de dithiothreitol de molar fresco, S30A e S30B e mantenha-os no gelo.
Depois de pesar um tubo vazio de centrífuga de 50 mililitros, pré-esfrie a menos 20 graus Celsius. Adicione dois mililitros de um dithiothreitol molar a um litro de tampão S30A no gelo e misture bem. Centrifugar as células a 6.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Depois de descartar o supernacido em um movimento rápido, adicione 250 mililitros de tampão S30A e resuspenque as células sacudindo as garrafas de centrifugação vigorosamente até que as células sejam dispersas homogêneamente. Em seguida, centrifugar as células novamente por seis minutos. Após a centrifugação, descarte o supernasciente e repita a adição do tampão S30A, seguido de centrifugação como demonstrado.
Em seguida, adicione dois mililitros de um DTT molar a um litro de tampão S30B no gelo e misture bem. Adicione 250 mililitros de tampão S30B às células e repita a centrifugação. Resuspengue a pelota celular em 10 mililitros de tampão S30B e transfira a suspensão celular para o tubo de centrífuga pré-refrigerado pré-refrigerado de 50 mililitros.
Se necessário, transfira as células residuais com um adicional de cinco a 10 mililitros de tampão S30B e encha o tubo para 50 mililitros de volume com S30B. Centrifugar as células por 10 minutos. Descarte o supernatante e repita a centrifugação em configurações anteriores, como demonstrado.
Depois de descartar o supernascer, aspire o supernatante S30B restante com uma pipeta de 100 a 200 microliter e pese a pelota celular molhada. Para cada grama de células molhadas, adicione 0,9 mililitros de tampão S30B. Resuspend as células usando uma pipeta Pasteur ou vórtice.
Centrifugar brevemente por cerca de 10 segundos até 500 G para sedimentar as células. Abaixe a ponta do sonicador na suspensão celular até que a ponta esteja cerca de um centímetro abaixo da superfície líquida. Insira diferentes parâmetros nas configurações do sonicator.
Defina a frequência para 20 kilohertz, amplitude para 65% de pulso ligado e desligado para 10 segundos, e tempo total de sônicação para um minuto. Inicie a sonicação e mova o tubo para cima ou para baixo e para os lados durante os dois primeiros ciclos de descanso para garantir que as células sejam uniformemente sônicas. Se as células não estiverem totalmentelisedas, inverta o tubo duas a três vezes e repita a sônica para um ou dois ciclos adicionais de 10 segundos com mistura frequente até que as células sejam totalmente interrompidas.
Centrifugar as células lisadas para remover os detritos celulares, em seguida, transferir o supernatante para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro como uma alíquota mililitro. Para a reação de escoamento dos extratos celulares, incubar a célula que contém o extrato celular a 30 graus Celsius por 60 minutos em um bloco de calor ou na incubadora sem um agitador. Para a reação de tradução de transcrição, descongele a solução SMM ou MES do extrato celular e o DNA plasmídeo no gelo.
Pré-arrefecar uma placa de 384-bem a menos 20 graus Celsius. Configure a reação de tradução de transcrição no gelo onde 25% do volume é DNA plasmídeo, 33,33% é extrato celular e 41,67% é solução SMM. Bata suavemente a mistura por cerca de cinco segundos em uma configuração de baixa velocidade para garantir que a solução seja homogênea, evitando espuma ou formação de bolhas.
Transfira três alíquotas de 10 microliters em três poços de uma placa de 384 poços como um triplicado técnico sem introduzir bolhas de ar. Depois de selar a placa com uma tampa transparente, gire a placa a 400 vezes G por cinco segundos e incubar a reação a 28 graus Celsius, seja em uma incubadora ou em um leitor de placas sem tremer. A transcrição-tradução livre de células de Estreptomíces venezuelae foi otimizada para expressão de alto rendimento de proteínas fluorescentes do plasmídeo padrão pTU1-A-SP44, bem como enzimas biossintéticas detectadas por eletroforese de gel.
A expressão do plasmídeo padrão pTU1-A-SP44-mScarlet-I foi medida utilizando vários métodos. As medidas de fluorescência em tempo real do mRNA usando o aptamer dBroccoli RNA, proteína mScarlet-I imatura usando o sistema de etiquetas FlAsH e proteína mScarlet-I madura foram realizadas. A coloração de fluorescência em gel de mScarlet-I usando tag FLAsH foi conduzida além da coloração Azul Coomassie da proteína total livre de células.
Após esse procedimento, ensaios de atividade podem ser realizados para estudar enzimas e caminhos que são desafiadores usando métodos padrão. Também se estende para a biossíntese ampliada e expressão genética de alto rendimento. Estamos desenvolvendo essa técnica para estudar enzimas metabólicas de bactérias GC altas.
Mostramos o potencial do nosso sistema para estudar a biossíntese ampliada em reações livres de células.
