당사의 프로토콜은 연쇄상 구균 베네수엘라 세포 없는 전사 번역을 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다. 우리의 시스템은 이 비모형 유기체에서 신진 대사 효소 그리고 통로를 이용합니다. 주요 장점은 높은 GC 함량을 가진 유전자의 이종 발현, 유리한 단백질 전달 환경의 제공 및 생합성 통로의 미세 조정을 위한 개방시스템입니다.
우리의 방법은 연쇄상 구균 및 관련 높은 GC 박테리아를 공부에 새로운 기회를 열 것입니다. 그것은 이 박테리아에 있는 효소 그리고 유전자 발현을 공부할 수 있습니다. 이 기술은 새로운 사용자가 쉽게 구현할 수 있기 위해 개발되었습니다.
사전 경험이나 친숙함을 필요로 하는 유일한 단계는 고활성 원유 추출물을 생산하는 초음파 처리입니다. 3일째에 배양전전을 시작하기 위해, 600나노미터에서 광학 밀도 또는 OD 측정을 위한 신선한 GYN 배지로 1대10의 비율로 야간 배양을 희석한다. 600 나노미터에서 배양의 OD가 0.3 미만인 경우, 흔들림 속도를 분당 250 내지 300회전으로 증가시키고 OD가 0.3에 도달할 때까지 성장한다.
2시간 이상 더 이상 성장하지 않습니다. OD가 0.3보다 큰 경우 배양기를 원심분리 용기로 옮기고 젖은 얼음에서 30분 동안 빠르게 식힙니다. 세포 배양이 식기를 기다리는 동안, 신선한 1개의 어금니 디티오트레이톨, S30A 및 S30B 버퍼의 4밀리리터를 준비하고 얼음위에 보관하십시오.
빈 50 밀리리터 원심분리기 튜브의 무게를 측정한 후 영하 20도에서 미리 식힙니다. 1개의 어금니 디티오트레이톨 2밀리리터를 얼음에 S30A 버퍼 1리터에 넣고 잘 섞습니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 6, 000배 G의 세포를 원심분리합니다.
빠른 움직임으로 상체를 폐기한 후, S30A 버퍼 250밀리리터를 추가하고 세포 덩어리가 균질하게 분산될 때까지 원심 분리 병을 격렬하게 흔들어 세포를 재장판한다. 그런 다음 세포를 6 분 동안 다시 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 폐기하고 S30A 버퍼의 추가를 반복한 다음 원심 분리가 입증된 대로 진행됩니다.
다음으로, 얼음에 S30B 버퍼 1리터에 1개의 어금니 DTT의 밀리리터 2밀리리터를 넣고 잘 섞습니다. 세포에 S30B 버퍼 250 밀리리터를 추가하고 원심 분리를 반복합니다. S30B 버퍼의 10 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 전무게 가성비 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 세포 현탁액을 전달한다.
필요한 경우 잔류 세포를 S30B 버퍼의 5~10밀리리터로 옮기고 튜브를 S30B로 50밀리리터 부피로 채웁니다. 세포를 10분 동안 원심분리합니다. 상체를 버리고 설명한 대로 이전 설정에서 원심 분리를 반복합니다.
상체를 폐기한 후, 나머지 S30B 슈퍼팔레트를 100~200 마이크로리터 파이펫으로 흡인시키고 젖은 셀 펠릿의 무게를 측정한다. 젖은 셀 1그램당 S30B 버퍼 0.9 밀리리터를 추가합니다. 파스퇴르 파이펫 또는 소용돌이를 사용하여 세포를 다시 중단합니다.
원심분리기는 세포를 퇴적시키기 위해 최대 500G까지 약 10초 동안 간략하게 한다. 팁이 액체 표면 아래 약 1센티미터가 될 때까지 초음파 처리기 팁을 셀 서스펜션으로 낮춥춥시다. 초음파 처리기 설정에서 다른 매개 변수를 입력합니다.
주파수를 20킬로헤르츠로 설정하고, 진폭은 65%펄스온및 오프 시간 에서 10초로, 총 초음파 처리 시간을 1분으로 설정합니다. 초음파 처리를 시작하고 세포가 균등하게 초음파 처리되도록 처음 두 휴식 주기 동안 튜브를 위 또는 아래로 옆으로 이동합니다. 세포가 완전히 제거되지 않으면 튜브를 2~3회 반전시키고 세포가 완전히 중단될 때까지 빈번한 혼합을 통해 1~2초 주기의 초음파 처리를 반복한다.
세포 잔해를 제거하기 위해 리시드 세포를 원심 분리한 다음 1밀리리터 알리쿼트로 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 상피체를 전달합니다. 세포 추출물의 유출 반응의 경우, 셀 추출물을 함유하는 세포를 30°C에서 60분간 열 블록 또는 셰이커 없이 인큐베이터에 배양한다. 전사-번역 반응의 경우, 세포 추출물 SMM 또는 MES 용액및 얼음에 플라스미드 DNA를 해동한다.
영하 20도에서 384웰 플레이트를 미리 식힙니다. 부피의 25%가 플라스미드 DNA인 얼음상에 전사-번역 반응을 설정하면, 33.33%는 세포 추출물이고 41.67%는 SMM 용액이다. 발포 또는 거품 형성을 피하면서 용액이 균일하다는 것을 보장하기 위해 저속 설정에서 약 5 초 동안 혼합물을 부드럽게 소용돌이시킵니다.
기포를 도입하지 않고 기술 삼중 판으로 10 마이크로 리터의 세 개의 알리쿼트3 개소로 전송합니다. 투명 커버로 플레이트를 밀봉한 후 5초 동안 400회 G로 플레이트를 회전시키고 인큐베이터 또는 플레이트 판독기에서 28도의 반응에 복유합니다. 연쇄상 구균 베네수엘라 세포 없는 전사-번역은 pTU1-A-SP44 표준 플라스미드로부터형 광등 단백질의 고수율 발현뿐만 아니라 겔 전기포에 의해 검출된 생합성 효소에 최적화되었다.
pTU1-A-SP44-mScarlet-I 표준 플라스미드의 발현은 여러 가지 방법을 사용하여 측정되었다. dBroccoli RNA aptamer를 이용한 mRNA의 실시간 형광 측정, FlAsH 태그 시스템을 이용한 미성숙 mScarlet-I 단백질, 성숙한 mScarlet-I 단백질이 수행되었다. FlAsH 태그를 사용하여 mScarlet-I의 인겔 형광 염색은 총 세포 없는 단백질의 쿠마시 블루 염색에 더하여 수행되었다.
이 절차에 따라, 활동 법은 표준 방법을 사용하여 도전적인 효소와 경로를 연구하기 위하여 수행될 수 있습니다. 그것은 또한 확대 된 생합성 및 높은 처리량 유전자 발현으로 확장. 우리는 높은 GC 박테리아에서 신진 대사 효소를 연구하기 위해이 기술을 개발하고 있습니다.
우리는 세포 없는 반응에 있는 생합성을 확장한 연구하는 우리의 시스템의 잠재력을 보여주었습니다.
