该方法可用于帮助研究人员使用简单有效的基于区域的分析来分析和计数细胞的共培养物。使用广泛使用的软件，该技术相对容易实现，并且提供了一种可靠而准确的方法来识别共培养环境中的各种细胞类型。这种方法可以深入了解细胞的特定共培养物如何协同作用以帮助组织再生。
该方法也可用于验证单一栽培生物标志物研究。首先，在一毫升DMEM中，在37摄氏度和5%二氧化碳下培养264.7个巨噬细胞，用于单一培养成像，其中补充有FBS，青霉素 - 链霉素，碳酸氢钠和β-巯基乙醇，密度为每厘米平方25， 000个细胞。在DMEM中培养NIH / 3T3细胞，补充10%FBS和1%青霉素 - 链霉素。
对于共培养成像，使用含有一份原始264.7培养基和一份NIH / 3T3培养基的共培养基以不同的比例和每平方25， 000个细胞的总密度培养264.7巨噬细胞和NIH / 3T3成纤维细胞。接种后，将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育，以达到80%细胞汇合的活细胞密度。要使用配备40X物镜的倒置显微镜采集细胞图像，请确定算法准确评估具有一系列图像质量的图像的能力。
获取具有不同病灶的灰度图像，生成非球茎和球状物图像，并将其导出到原始 czi 文件中。要使用基于面积的方法获取细胞的图像，请将用于分析的图像文件复制并粘贴到 bin 中，然后通过执行命令输入文件名。按“运行”启动程序。
通过重建打开来分析图像，然后使用源函数通过重建来关闭图像，通过执行相应的命令从背景放大前景。为了利用基于百分位数的识别系统对重建的图像进行二值化，通过使用与最大相关像素的百分位数差来区分细胞与背景，其最大像素值至少包含给定图像的0.5%。分析和评估原始 264.7 巨噬细胞的像素值，确保这些值在最大相关像素的 4.5% 以内。
然后将像素标记为蜂窝移动网络。对于包含球茎细胞轮廓的图像，请实施迭代过程以纠正细胞中心处的错误二值化。确定总小区覆盖范围的初始猜测。
运行算法并使用 alpha 和 kappa 的初始估计值分析图像，以填充一部分岛屿。然后使用分析后的细胞计数和覆盖率重新计算 kappa。要确定图像二值化后的平均单元格面积，请通过执行该命令获取图像内找到的所有中心位置和圆的半径的矢量。
使用半径输出通过平均和分析至少 10 个像元来计算平均像元面积，以确保准确的面积识别。使用前面所述的命令执行图像分析。然后通过使用原始264.7和NIH / 3T3细胞的图像实验确定参数phi，对含有原始264.7和NIH / 3T3细胞的共培养物进行分析。
猜测初始 phi 值并进行迭代，直到细胞计数和覆盖率与原始 264.7 和 NIH/3T3 共培养物特异性的手动计数紧密匹配。确定总细胞覆盖率中的原始264.7个细胞计数，如前所述，对于单一培养图像。在没有phi参数的情况下再次分析流域变换图像，检测巨噬细胞和成纤维细胞。
通过选择性地减去使用前面描述的标准阈值和基于面积的定量方法获得的原始264.7个细胞像素来获取NIH / 3T3成纤维细胞数据。对非球茎原始264.7巨噬细胞进行分析，并记录算法输出。使用算法计算图像的平均面积计算226个细胞，同时手动计数鉴定了241个细胞，其近似误差值为6%，还进行了球茎原始264.7巨噬细胞的分析。
使用算法对221个细胞进行图像的平均面积计算，通过手动计数252个细胞进行验证，其近似误差值为12%，对含有原始264.7巨噬细胞和NIH / 3T3成纤维细胞的共培养物进行分析。原始264.7巨噬细胞计数的算法输出为137，而手动计数鉴定出155个细胞，误差值为11%为了确定细胞计数算法的鲁棒性，通过自动细胞识别和手动用户计数对5个原始的264.7巨噬细胞图像进行计数。在五幅图像上，平均参数为0.85，获得了骰子系数。
该方案中的关键步骤是使用基于百分位数的参数，从而可以在单培养和共培养图像中进行可靠的细胞检测。该协议可用于鉴定感兴趣的细胞，以便使用分子生物学技术进行进一步分析，以评估定义共培养系统中特定细胞群和生物标志物开发的生物标志物。
