该协议说明了如何在小鼠大脑和成年斑马鱼中进行体内深部组织三光子显微镜检查。生命科学领域两个重要的模型系统。长波长三光子显微镜能够在双光子显微镜无法进入的深度对完整的组织或器官进行体内高空间分辨率成像。
这种技术可以帮助我们了解神经系统疾病的潜在机制，如阿尔茨海默氏症和自闭症，在这些疾病如何影响大脑缺乏完整的理解。来自我们实验室的博士后研究员Kibaek Choe将演示小鼠脑成像程序，并演示斑马鱼脑成像程序的将是来自Fetcho研究实验室的研究助理Kristine Kolkman。首先，打开激光器并将非共线光学参数放大器的惰轮输出的中心波长设置为1，300或1，700纳米，然后在光路上放置脉冲压缩器以预啁啾飞秒激光器并优化三光子成像的脉冲持续时间。
将硅板和激光路径之间的角度设置为布鲁斯特角度以最大化激光透射率，然后旋转硅板以通过最小化反射来实现布鲁斯特角度。接下来，放置翻转镜以方便地在1，300和1，700纳米光束线之间切换。将安装在旋转载物台上的半波片和偏振分束器放置在激光器上以控制激光的强度，然后在分束器的反射路径中放置阻挡器。
准备一个培养皿，用0.5厘米的2%高熔点琼脂。一旦琼脂冷却并凝固，在琼脂上切一个比鱼更长，稍宽的矩形孔。使用蜡，将薄管连接到培养皿上，一端在矩形中，将较大直径的管道连接到培养皿的边缘。
接下来，通过将鱼放入每毫升0.2毫克的三卡因溶液中来麻醉鱼，然后将麻醉的鱼侧放在湿海绵上，然后使用微注射器，向后轨道注入3微升泮库溴铵以麻痹鱼并将其短暂地置于Hank的溶液中以确保其完全瘫痪。接下来，将鱼背朝上放在培养皿中，头部朝向管子，然后使用镊子轻轻张开鱼的嘴并将管子滑入口中。轻轻地将鱼滑向管子，使管子在鱼的嘴后面。
快速但轻轻地将鱼周围的琼脂擦干，并去除鱼顶部的水。将一小块实验室组织浸入实验室胶水中，然后将组织放在鱼的两侧的琼脂上，并在鱼的后尾部到鳃上。接下来，通过将一小滴布比卡因直接放在头部表面来麻醉鱼的皮肤，然后将与鱼一起带到显微镜下。
用鱼设施水填充盘子，并将管道连接到水泵，以将系统水泵入鱼的嘴里。确保用水用起泡器含氧，并用水族箱加热器加热到30摄氏度。对于成像，将低倍率物镜放在三光子显微镜上，然后将含有鱼和管的培养皿置于显微镜下，并使用LED光源照亮培养皿。
从图像采集软件中，打开相机模式，单击实时，选择屏幕右侧的通道A并调整直方图设置以清晰地看到图像。将电机控制器上的电机设置设置为底座后，降低物镜，直到鱼可见。将鱼头的中心放在视野的中心，然后将物镜向上移动并远离鱼头。
将低倍率物镜更换为高数值孔径物镜进行三光子成像，然后将其靠近鱼头。将所有电机的轴值设置为零。慢慢降低物镜，确保物镜不会物理接触头部。
在CCD相机软件中，当头部顶部可见时，停止移动物镜，并将X，Y和Z位置设置为零。关闭LED光源，关闭系统周围的暗幕，然后将成像采集软件设置为多光子GG模式进行三光子成像，并将物镜下的功率设置为小于1毫瓦。单击图像采集软件中的“实时”按钮。
打开PMT通道，并根据需要调整PMT增益和背景电平。通过监测来自大血管和窗户玻璃表面的THG通道，缓慢向上移动物镜以定位头部表面。将物镜靠近窗口后，在物镜和颅窗之间加水，然后将所有电机的轴值设置为零。
单击图像采集软件中的“实时”按钮。打开PMT通道并根据需要调整PMT增益和背景水平，然后通过监测来自大血管和窗户玻璃表面的THG通道，缓慢向上移动物镜以定位盖玻片的表面。如果需要，调整窗口方向，然后将电机归零以定义大脑表面。
执行成像并根据成像深度调整功率级别。使用三光子显微镜对成年斑马鱼大脑中的遗传标记神经元进行高分辨率，非侵入性和深度成像。还可以观察到光学结构和小脑中细胞层的分布。
显微镜的相机功能用于定位鱼。头骨在THG通道中可见，这有助于导航大脑并找到顶部表面。神经元在成人大脑深处具有高信号与背景比。
这里显示了GCaMP6s标记神经元和德克萨斯红标记血管的多色三光子图像以及成年小鼠大脑中的THG信号。通过设置优化，在CA1海马体区域的大脑表面成功获得低至1.2毫米的高对比度图像。GCaMP6s标记神经元的钙活性痕迹在750微米的深度进行10分钟的记录会话，显示出高记录保真度。
这种设置可以帮助可视化神经元活动，以了解大脑功能。它还可用于跟踪生物组织内的细胞运动，以了解各种生物系统。此外，还可以测量血流速度以监测动物的健康状况。
