这是一种简单且可视化的方案，可演示在两种不同的亚培养过程中处理食管腺癌类器官，伴有和不伴有单细胞消化。以两种不同的方法传代培养EAC类器官的标准化方案可以支持研究人员在基于EAC PDO的实验中为不同的下游应用选择合适的技术。在处理PDO时，必须注意每个步骤中的细节。
基于团队的 SOP 对于 POD 的质量至关重要。演示该程序的将是我们的博士生Ning Bo Fan和实验室的技术助理Lisa Raatz。使用二氧化碳在37摄氏度下过夜孵育12孔板。
如果可用，使用平板中的空孔和患者来源的类器官培养物。将适当体积的ECM凝胶在冰上孵育一小时以液化。将细胞回收溶液放在冰上。
从培养箱中取出装有生长PDO的板。使用真空泵吸出旧介质。将每圆顶冰冷细胞回收溶液加入500微升到孔中。
通过上下移液几次来分解ECM凝胶，使用具有宽孔的1， 000微升吸头将ECM凝胶圆顶破碎成小块。从最多两个孔中混合PDO，ECM凝胶和细胞回收溶液，并将其转移到五毫升低结合管中。将此管在冰上孵育20分钟。
通过倒置管子每五分钟混合一次。以500倍G的速度在四摄氏度下离心管四分钟。如果没有可见的沉淀，用真空泵小心地除去上清液，直到达到含有ECM凝胶PDO溶液的相，并加入三毫升冰冷的细胞回收溶液。
将管子倒置几次，然后在冰上孵育10分钟。在4摄氏度下以500倍G离心4分钟。使用真空泵或1， 000微升移液器小心地丢弃上清液。
尽量去除上清液。将PDO颗粒储存在冰上。从零下20摄氏度的冰箱中取出预冷的201， 000微升宽孔头，并将其放在干净的工作台上。
计算每个计划用于播种的圆顶50微升的ECM凝胶，加上额外的50微升。然后使用预冷的1， 000微升吸头将沉淀重悬于ECM凝胶中，并通过上下移液约10次混合。在播种圆顶之前，从培养箱中取出预热的12孔板。
将含有50微升ECM凝胶的圆顶播种到温暖的板中。将板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育20至30分钟，以固化ECM凝胶。小心地添加预热的PDO介质，而不会干扰圆顶。
在显微镜下监测播种的PDO。培养PDO7至14天，直到达到所需的密度和形态。通过将两毫升0.25%胰蛋白酶EDTA和20微升DNAase I混合以消化从两个孔中收获的PDO来制备消化培养基。
将先前制备的沉淀重悬于适当体积的预热的0.25%胰蛋白酶EDTA和DNAase I中，并使用1，000微升移液管上下移液将其混合约10次。在转速至少为 28 RPM 的旋转培养箱中以 37 摄氏度孵育 10 分钟。制备含有6毫升大豆胰蛋白酶抑制剂溶液的15毫升管。
消化后，用1， 000微升移液管将消化的PDO彻底混合几次，以破坏PDO。将消化的PDO转移到含有SDI溶液的15毫升管中以停止消化。在4摄氏度下以500倍G离心4分钟。
使用真空泵或1， 000微升移液器小心地丢弃上清液。将沉淀重悬于一毫升基础培养基中。使用自动细胞计数器或血细胞计数器确定细胞浓度和活力。
根据计划用于播种的圆顶计算细胞数量，加上一个额外的圆顶，并将它们转移到新鲜的1.5毫升低结合管中。在4摄氏度下以500倍G离心4分钟。使用1， 000微升移液管小心地丢弃上清液。
使用预冷的1， 000微升宽孔头向沉淀物中加入适当体积的ECM凝胶。通过上下移液约10次混合。如前所述，将消化的PDO播种到12孔板中。
用先前制备的沉淀物开始未消化PDO的冷冻保存过程。使用500微升冷冷冻介质从两个圆顶重悬沉淀并将其转移到低温小瓶中。使用适当的细胞冷冻容器在冰箱中冷冻PDO过夜。
将冷冻的PDO转移到零下150摄氏度的冰箱中。对于消化的PDO的冷冻保存，将细胞转移到新鲜的1.5毫升低结合管中。在4摄氏度下以500倍G离心4分钟。
使用1，000微升移液器小心地丢弃上清液。将沉淀重悬于500微升冷冻介质中，并将其转移到低温小瓶中。使用适当的细胞冷冻容器在零下80摄氏度的冰箱中冷冻PDO过夜，并将其转移到零下150摄氏度的冰箱中长期储存。
没有单细胞消化的传代培养需要更少的时间即可达到可比的密度，并且主要导致结构紧凑。相比之下，单细胞消化的PDO显示出具有空心核心的结构。该图显示了具有紧凑和中空结构的石蜡包埋EAC PDO的苏木精曙红染色和免疫组织化学染色。
全血细胞蛋白能够识别上皮肿瘤细胞。细胞角蛋白7突出了腺体分化肿瘤细胞。致密结构主要存在于未消化的培养物中，而空心结构在经过单细胞消化的培养物中占主导地位。
Ki67突出了具有更高细胞增殖的细胞群。红色的Ki67和绿色的PanCK在EAC初级组织，EAC PDO致密结构和EAC PDO中空结构中分布相似。该图显示了基于单细胞的冷冻保存和基于未消化的基于PDO的冷冻保存从冷冻储备中恢复的第一天的EAC PDO的形态学特征。
我们建议提前制定明确的亚文化计划。在传代培养PDO时，温度控制和温和移液对于正确处理ECM凝胶至关重要。我们的方案为研究人员提供了根据其研究目的维护其EAC PDO的大量资金，用于下游分析，例如药物筛选测定，流式细胞术或组织学分析。
我们希望我们的工作可以帮助类器官研究人员快速轻松地决定类器官的储存和亚培养，特别是在转化研究中患者衍生材料的稳健结果。
