在 3D 类器官中模拟口腔-食管鳞状细胞癌

食管鳞状细胞癌（ESCC）在世界范围内是致命的和普遍的。三维类器官可用于加速该领域的进展，以应对ESCC的严重负担。来自用4NQO处理的小鼠的单细胞衍生的3D类器官可以很容易地和廉价地操作，以对伴随ESCC启动和发育的分子变化进行功能注释。

该模型捕获了诱变原诱导的肿瘤的遗传异质性。因此，这些类器官提供了一个生理相关的平台来测试新的治疗策略或识别驱动肿瘤发生的显着遗传变化。帮助展示动物解剖和器官收集的是工作人员Yasuto Tomita，工作人员助理，演示用于石蜡包埋程序的类器官的制备将由我实验室的博士后研究员Norihiro Matsuura。

首先，通过捏中腹皮毛并使用手术剪刀打开安乐死小鼠的皮肤，从下腹部到下巴做一个颅尾腹中线切口。从中线切口开始，进行径向切口延伸到小鼠两侧的四肢，使皮瓣膨胀。要暴露颈气管，请使用解剖剪刀将唾液腺分开中线。

要暴露胸气管，请切除胸骨。用镊子轻轻捏住并提起腹膜，然后用剪刀将腹膜颅尾分开。并沿肋骨横向。

轻轻地将肝脏从横膈膜的尾部表面收回，并使用剪刀在胸骨切口处的横膈膜上做一个小切口，特别是在剑突的背表面。一旦肋骨与胸内容物分离，将剪刀插入横膈膜的切口，并解剖紧贴胸骨背表面的颈带，以避免损伤下面的器官。用剪刀剪断胸骨两侧的肋骨并移除胸骨。

要暴露腹部食道，请用镊子握住胃窦，轻轻地向前提起胃。用剪刀从胃和食道解剖脾脏、胰腺和肠系膜。要暴露胸食管，请立即轻轻抬起气管尾部至甲状腺软骨，并使用虹膜剪刀解剖气管背侧的食管。

用虹膜剪刀将甲状腺软骨处的气管分开。通过小心地在尾部方向解剖气管，从食道的其余部分剥离气管。用气管完全切除肺、心脏和胸腺。

用剪刀将幽门处的胃分开。用镊子夹住胃窦并解剖颅骨，将食道与椎骨分开。将食道分开到甲状腺软骨的水平，并完全收获食道和胃。

通过在贲门处分离食道来分离胃和食道，并解剖食道外表面的任何筋膜。要保留用于组织学的样本，请用剪刀纵向分开。将剩余的完整食道和冷的PBS放在冰上。

沿着较大的曲率打开胃，并用PBS充分清洗。分离前胃并用冷PBS清洗。要收获舌头，请从鼻子上取下针头，然后用镊子拔出舌头。

尽可能长时间地切开舌头，并将其放在冰上的冷PBS中。将解离的组织转移到培养皿中后，使用镊子小心地从上皮上去除肌肉层。将上皮细胞转移到含有500微升0.25%胰蛋白酶的微量离心管中，并在37摄氏度和800rpm的温度混合器中孵育10分钟。

短暂离心后，通过保持在50毫升锥形管上的100微米细胞过滤器转移细胞悬液，使用圆周运动进行宽口径尖端，然后加入3毫升大豆胰蛋白酶抑制剂或STI，通过过滤器使用圆周运动洗涤，然后用1毫升结核菌素注射器柱塞的底部擦洗过滤器以推动细胞通过。用3毫升PBS清洗过滤器3至5次，在洗涤之间用注射器底部擦洗过滤器。通过离心沉淀细胞后，除去上清液，在管中留下1毫升溶液进行重悬。

一旦沉淀被重新悬浮，通过70微米细胞过滤器将细胞悬液转移到一个新的50毫升锥形管中。再次离心管后，将沉淀重悬于100微升小鼠类器官培养基或MOM中，并进行自动细胞计数。在75%基底膜提取物或BME和MOM中板5，000个活细胞，每孔总体积为50微升。

使用200微升宽口径尖端，在每个孔的中心缓慢添加50微升液滴，避免尖端与孔底部或侧面接触。让BME在37摄氏度的培养箱中凝固30分钟，5%二氧化碳和95%相对湿度。孵育后，每孔小心地加入500微升MOM。

在第 3 天或第 4 天更换 MOM，然后每 2 到 3 天更换一次，直到准备好通过。使用前将解冻的 BME 放在冰上，预热 MOM、0.05% 胰蛋白酶和 STI 至 37 摄氏度。使用宽口径微量移液器吸头，将 BME 圆顶中的类器官与上清液一起收集，并通过上下移液破坏 BME。

通过短暂离心获得类器官沉淀后，一旦将其移开，将其重悬于500微升0.05%胰蛋白酶中。将管在37摄氏度和800 rpm的热混合器中孵育10分钟。用600微升STI灭活胰蛋白酶。

离心并弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于100微升MOM中。通过台盼蓝排除进行自动细胞计数。要固定类器官，轻轻地移开沉淀并在 300 微升 4% 多聚甲醛中重悬 4 摄氏度过夜。

接下来，通过倒置微量离心管架并用天花板薄膜覆盖表面来准备包埋表面，然后用相应的类器官ID标记。通过在管的侧面添加50微升琼脂，小心地覆盖在PBS洗涤的类器官沉淀中去除的多聚甲醛。重复此步骤。

在不干扰沉淀的情况下，将琼脂凝胶液滴中的沉淀转移到包埋表面上的天花板膜上，以便在 4 摄氏度下固化 45 分钟。使用镊子，小心地将含有固化类器官颗粒的液滴转移到标记的病理盒中。通过明场成像和组织学染色对正常鼠食管舌和前胃类器官进行形态分析。

来自4NQO治疗小鼠的食管鳞状细胞癌显示核异型性和突然角化。通过测定传代培养时类器官形成率评估的类器官自我更新能力表明，形成速率随时间下降，反映了成熟类器官中增殖基础细胞的减少。类器官的生长动力学通过它们在不同时间点的形态来揭示。

类器官内核的角质化在第10天变得突出。增殖性基底细胞保留在最外层的细胞层中，即使在第14天和第21天的时间点也是如此。由4NQO未处理小鼠产生的正常小鼠舌类器官的群体倍增曲线表明它们在多次传代和长期培养中稳定生长。

类器官是用于高通量筛选以识别新治疗靶点的平台，基于CRISPR的编辑用于询问特定基因功能或共培养以定义肿瘤微环境中的哪些相互作用影响转化。这项技术使我们能够研究部分EMT和HPV感染等现象，以及它们与呼吸消化道鳞状细胞癌生物学中免疫系统的相互作用。