以前的方法依赖于在体外获得间充质干细胞的高侵入性方法，但这些间充质干细胞具有产生30%异质池的局限性，效率范围为30%至60%在这里，我们提出了一种用于产生大量快速增殖的间充质干细胞的方案，该干细胞可以通过使用尼罗河红进行分类来产生纯的成熟脂肪细胞群。当iPSCs达到80%汇合时，用DPBS洗涤细胞并加入含有EDTA的解离培养基。将细胞在 37 摄氏度下孵育一分钟。
一分钟后，吸出解离试剂并将细胞置于37摄氏度下再放置一分钟。接下来，从培养箱中取出板。每孔加入一毫升StemFlex培养基，并小心地将细胞收集在15毫升锥形管中。
离心细胞。除去上清液，并轻轻地将它们重悬于含有10微摩尔岩石抑制剂的3毫升MSC分化培养基中。混合细胞悬液，并在24孔超低附着板中每孔分配500微升。
然后将板放入37摄氏度的培养箱中。24小时后，为了诱导获得的胚胎体，将它们收集在15毫升的管中并让它们沉淀下来。15分钟后，除去上清液，加入补充有10微摩尔维甲酸的MSC分化培养基。
轻轻地重悬胚胎体，并在相同的24孔超低附着板中分配每孔500微升。然后将板放入培养箱中。48小时后，将胚胎体收集在15毫升的管中，让它们静置15分钟。
然后除去上清液，加入补充有0.1微摩尔维甲酸的MSC分化培养基。重悬胚胎体后，在同一24孔板中每孔分配500微升，并将板放入培养箱中。最后一次视黄酸处理后48小时，收集胚胎体，除去上清液，加入不含细胞因子的DMEM低葡萄糖培养基。
在同一 24 孔超低附着板中轻轻重悬并分配每孔 500 微升细胞悬液，然后在 37 摄氏度下孵育板。48小时后，将iPSC来源的胚胎小体铺板，将胚胎小体收集在15毫升管中，使其沉降，然后除去上清液，并重悬于两毫升新鲜MSC分化培养基中。接下来，将悬浮液转移到基底膜基质涂层的六孔板的两个孔中，并在37摄氏度下孵育细胞。
五天后，用含有每毫升2.5纳克碱性成纤维细胞生长因子的新鲜MSC分化培养基替换用过的培养基，并继续MCS分化长达11天和15天。当铺好的胚胎体达到80%至90%汇合时，通过用DPBS洗涤，加入胰蛋白酶-EDTA，并在37摄氏度下孵育一分钟。从平板中取出胰蛋白酶-EDTA，并在37摄氏度下再次孵育一分钟。
接下来，每孔添加一毫升培养基。三分钟后，使用MSC分化培养基在15毫升锥形管中收集细胞并离心细胞。然后将细胞重悬于含有碱性成纤维细胞生长因子的MSC分化培养基中，并以1:3的比例将细胞接种在基底膜基质包被的平板上。
在MSCs达到90%汇合后，继续培养它们48小时，以使它们经历一段时间的生长停滞。然后取出培养基并用DBPS洗涤细胞。洗涤后，将完整的脂肪细胞分化培养基添加到平板中，并将细胞在37摄氏度下孵育。
每隔一天更换培养基，持续 14 天。将 iPSC 来源的 MSC 分化为脂肪细胞。要使用尼罗河红对脂肪细胞进行分类，请按照文本手稿中的说明在DMSO中制备尼罗河红工作溶液。
使用前，解冻储备溶液并将其在DPBS中复溶，以达到300纳摩尔的工作溶液浓度。在脂肪细胞分化的第14天或之后，从细胞中丢弃培养基并使用DPBS洗涤。然后加入尼罗河红工作溶液。
盖上平板并在37摄氏度下孵育细胞。15分钟后，用胰蛋白酶-EDTA替换尼罗河红溶液，并将细胞在37摄氏度下孵育四分钟。然后使用含有5%FBS的DMEM在15毫升锥形管中收集细胞并离心细胞。
除去上清液并以每毫升100万个细胞的密度将细胞重悬于DPBS中。然后使用 FACS 分选仪，使用 FL-1 通道分离尼罗河红阳性细胞。收集分选的细胞并在脂肪细胞分化培养基中重新培养它们，或进行RNA提取，然后对脂肪细胞分化标志物进行定量分析。
在开始分化时，悬浮接种的细胞是圆形的，具有明确的细胞边界，直径为小到中等尺寸。胚胎体的生存能力是通过快速增殖行为来观察到的，从而产生更多的MSC。这种快速增殖行为以及它们奇特和细长的形态即使在将MSC传代到新鲜的基质包被板上后仍能保留。
良好的分化可产生可靠的MSC，间充质表面标志物CD73、CD44和CD90的表达效率大于90%。此外，对细胞缺乏描述造血表型CD14，CD34和CD19的表面标志物的评估显示表达效率低于1%，FABP4（终末分化脂肪细胞的标志物）在细胞质分布中的高表达表明其发育成熟。此外，脂联素（脂肪细胞成熟的另一个标志物）的高表达表明脂肪细胞的功能足以响应葡萄糖信号传导进行脂质储存和脂肪生成。
染色后，尼罗红仅与含脂成熟脂肪细胞结合，使其成为使用荧光激活流式细胞术分选成熟脂肪细胞的有效工具。与未分选的细胞相比，尼罗河红阳性细胞的成熟标志物显着上调至少两倍。在胚胎体形成和间充质细胞解离过程中收集细胞时，您必须非常温和，因为这会极大地影响间充质干细胞解离后的存活效率。
从携带突变的患者获得的纯脂肪细胞群可以进行功能和全转录组测序，以确定受特定突变影响的调节和信号通路，而数据不受样品异质性的影响。该技术将允许在体外可扩展地生成间充质干细胞，无需从人类供体中收集它们，以便于将它们分化为脂肪细胞，软骨细胞和骨细胞，以了解与组织相关的疾病发病机制。
